響應面法優化高良姜中高良姜素的提取工藝

唐陽，周頁，吳珊，王潔雪

（成都師范學院 化學與生命科學學院功能分子研究所，四川成都 611130）

高良姜為姜科山姜屬植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）的干燥根莖[1]，分布在我國的廣東、貴州、福建、海南、云南、廣西和四川等地，別稱蜜姜、南姜、小良姜、良姜等。高良姜性熱味辛，具有消食、止痛、溫中散寒之功效[2]，是治療冷腸泄瀉、反胃吐食、胃寒少食等癥狀的良好藥材[3]。高良姜含有多種化學成分，其中黃酮類成分高良姜素（Galangin，3,5,7-三羥基黃酮）是高良姜藥材的主要藥效成分，同時也是該藥材的質量控制成分[4-6]。由于高良姜素能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖，且毒性較低，是一種具有良好開發前景的天然化學預防藥物，已成為國內醫藥界研究與開發的熱點[7]。

本文以高良姜素為對照品，采用高效液相色譜法[8-9]，通過單因素實驗結合響應面法優化高良姜中高良姜素的最佳提取工藝，為進一步開發高良姜藥材提供有用的數據和可靠的技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters2695高效液相色譜儀、AUW120D電子分析天平、ULTRASONIC CLEANER超聲儀、NAIZFCDY-6索氏提取器、HU-ZK4電熱恒溫水浴鍋。

高良姜藥材，購自成都市荷花池中藥材市場；高良姜素對照品（HPLC=98.31%，成都康邦生物科技有限公司生產），乙腈為色譜純，磷酸為優級純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 色譜條件

色譜柱：SHIMADZU shim-pack GISS C18（4.6×250 mm 5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：265 nm；進樣量：10 μL。

1.3 高良姜素標準曲線的繪制

精密稱取高良姜素對照品10.34 mg，置于10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，制得1.034 mg/mL高良姜素對照品貯備液。分別取高良姜素對照溶液4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL和14 μL進樣分析，以峰面積（Y）為縱坐標、進樣體積（X）為橫坐標進行線性回歸，得到高良姜素的回歸方程為Y=4 590 999X+8 770 984，R2=0.999 7。表明高良姜素在4.136～14.476 μg范圍內呈良好的線性關系。

1.4 樣品溶液的制備

精密稱取高良姜藥材1.0 g，干燥后粉碎過40目篩，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入一定濃度的乙醇溶液，在相應溫度下超聲提取規定時間，離心，定容至10 mL，得樣品溶液。高良姜提取液經0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾液10 μL進行高效液相色譜分析，并根據峰面積計算高良姜素得率。計算公式：高良姜素得率（mg/g）=提取得到的高良姜素質量（mg）/高良姜藥材質量（g）。

以高良姜素含量為評價指標，分別考察不同提取時間、提取次數、料液比、乙醇濃度對高良姜中高良姜素含量的影響。依據單因素實驗結果確定因素水平范圍，利用Design Expert Software 軟件輔助手段設計響應面試驗。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲時間對高良姜素得率的影響

固定料液比1∶8，乙醇濃度為90%，超聲溫度50 ℃，超聲提取2次，考察不同超聲提取時間對高良姜素提取率的影響。結果如圖1顯示，從10～30 min提取率隨提取時間的延長而增加，在25 min時達最大值0.90，再延長超聲時間，提取率趨于平穩，略有下降。因此，選擇超聲時間在25 min左右適宜。

2.1.2 提取次數對高良姜素得率的影響

固定料液比1∶8，乙醇濃度為90%，超聲溫度50 ℃，提取25 min，考察不同提取次數對高良姜素提取率的影響。圖2結果表明，隨著提取次數增加，提取率升高，在3次后提取率增加不明顯，增幅為2%。綜合實驗工作量及提取率，選擇提取次數在2次左右適宜。

2.1.3 料液比對高良姜素得率的影響

固定乙醇濃度為90%，超聲溫度50 ℃，提取25 min，提取2次，按照料液比1∶4、1∶6、1∶8、1∶10和1∶12加入提取溶劑，考察不同料液比對高良姜素提取率的影響。圖3結果表明，1∶8的料液比達到最大的提取率0.97，再增大料液比，高良姜素得率反而下降，可能的原因隨著料液比的增大，其他物質的溶出增加。因此，料液比為1∶8左右為宜。

2.1.4 乙醇濃度對高良姜素得率的影響

固定料液比為1∶8，超聲溫度50 ℃，提取25 min，提取2次，考察不同乙醇濃度對高良姜素提取率的影響。圖4結果表明，80%～100%乙醇濃度范圍內，高良姜素提取率隨乙醇濃度增加而升高，原因可能是高良姜素化合物極性較低的原因。因此，選擇提取乙醇為無水乙醇。

2.2 響應面法優化高良姜素提取條件

2.2.1 響應面優化實驗

根據單因素試驗結果，采用Box-Behnken中心試驗設計，以對高良姜素得率影響最大的幾個因素為自變量，以高良姜素得率（Y）為響應值進行響應面試驗。響應面的因素與水平設計見表1，結果見表2

圖1 提取時間對高良姜素得率的影響

圖2 提取次數對高良姜素得率的影響

圖3 料液比對高良姜素得率的影響

圖4 乙醇濃度對高良姜素得率的影響

表1 響應面的因素與水平設計

表2 響應面優化實驗結果

2.2.2 回歸方程的建立與方差分析

利用 Design -Expert 軟件對表2數據進行分析，得到二次多項式回歸方程，高良姜素得率Y=+0.91+0.0025A-0.059B+0.056C-0.001AB+0.005AC-0.082BC-0.058A2-0.010B2+0.050C2，該多元回歸模型的方差分析及顯著性檢驗結果見表3。

由表3可知，回歸項P=0.002 6＜0.01，回歸模型極顯著，在統計學上有意義。失擬項用來表示所用模型與實驗擬合的程度，即二者差異的程度。失擬項P=0.326 8＞0.05，影響不顯著，說明模型擬合度很好。因此，能夠使用該回歸模型對試驗數據進行分析，優化高良姜中高良姜素的提取工藝參數。各因素對高良姜素得率的影響次序為：料液比＞乙醇濃度＞提取時間。

為了觀察某個因素及其交互作用同時對高良姜素得率的影響，將其他因素保持條件不變，獲得每個因素及其交互作用對高良姜素得率影響的一組動態響應曲面圖（圖5～7），從而確定因素的最佳參數范圍。

圖5 提取時間與料液比交互作用對高良姜素得率的影響

表3 回歸方程中系數的顯著性檢驗

圖6 提取時間與乙醇濃度交互作用對高良姜素得率的影響

圖7 料液比與乙醇濃度交互作用對高良姜素得率的影響

由圖5可以看出，固定料液比、增加提取時間有利于提高高良姜素得率，繼續增加提取時間，高良姜素得率反而下降。由圖6可以看出，固定提取時間，增大乙醇濃度有利于提高高良姜素得率。由圖7可以看出，料液比與乙醇濃度交互作用曲面最陡峭，說明兩者交互作用對高良姜素得率影響最為顯著。固定乙醇濃度，減小料液比有利于提高高良姜素得率。

2.3 優化工藝的驗證

通過Design -Expert軟件方程求解，以高良姜素得率為響應值，根據響應面分析得到最佳提取高良姜素的工藝為：料液比為1∶6的無水乙醇超聲提取2次，每次25 min，高良姜素得率為1.15%。為驗證響應面分析法所得結果的可靠性，采用上述優化條件進行3次平行試驗。實際測得的高良姜素得率的平均值為1.13%。結果說明預測值與實際值之間有很好的擬合性，進一步驗證了該模型的可行性。

3 結論

本實驗采用HPLC作為純化指標檢測方法，通過單因素試驗考察提取時間、提取次數、料液比、乙醇濃度對高良姜素得率的影響，進一步通過響應面法分析各因素交互作用對高良姜素得率的影響，優化得到提取高良姜素的最佳工藝，料液比為1∶6的無水乙醇超聲提取2次，每次25 min，高良姜素得率的平均值為1.13%。優化的提取工藝操作簡便，且設備要求不高，提取使用的溶劑對環境無污染，使用的乙醇可回收蒸餾后重復使用，故提取成本較低，在后續工作中，按照此提取工藝大量制備高良姜素，以此開展相關的活性測試研究。