酶法水解牛骨蛋白制備蛋白胨生化試劑的工藝

黃菊，楊君麗，曾吉偉

（南寧龐博生物工程有限公司，廣西南寧 530031）

蛋白胨是蛋白質(zhì)經(jīng)酸、堿或酶水解得到的一種由胨、肽、氨基酸等組成的混合物，富含有機(jī)氮化合物、維生素和糖類，可作為微生物培養(yǎng)基中最主要的基礎(chǔ)成分。從骨中提取蛋白胨，傳統(tǒng)方法采用酸、堿水解法。酸水解色氨酸會(huì)被完全破壞掉，天門冬酰胺和谷氨酰胺將會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)樘扉T冬氨酸和谷氨酸，半胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡装彼?，絲氨酸和蘇氨酸會(huì)發(fā)生部分水解。堿水解會(huì)破壞精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。堿法水解蛋白會(huì)使L-氨基酸變成D-氨基酸，還可形成具有毒性的Lys-ALa復(fù)合物。且酸堿法產(chǎn)生會(huì)產(chǎn)生大量廢水，造成環(huán)境污染，治理成本高。

酶水解法是利用動(dòng)植物或微生物的蛋白酶，在一定pH、溫度、濃度下添加生物酶進(jìn)行水解，水解蛋白質(zhì)的氨基酸不會(huì)受到破壞，也不會(huì)產(chǎn)生消旋作用。酶法水解溫度較低，反應(yīng)時(shí)間較短，工藝簡單易控制，產(chǎn)品理化性質(zhì)穩(wěn)定。本文主要針對酶法水解牛骨蛋白的工藝進(jìn)行研究，篩選出適合蛋白酶及其合適的酶解溫度、pH值、濃度及添加量等工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛骨：南寧魯班路肉聯(lián)廠；蛋白酶：胰酶、堿性酶、木瓜酶、復(fù)合酶（南寧龐博生物工程有限公司）；主要試劑：氫氧化鈉、鹽酸、甲醛、硫酸等試劑均為市售分析純、細(xì)菌、胰蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C精密pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；L8900型氨基酸自動(dòng)分析儀（日立）、JC-DN-04C型凱氏定氮儀（青島聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司）、YJ501型恒溫水浴鍋（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）、LS-B75L型蒸汽滅菌器（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）、、JB-2型恒溫磁力攪拌器（上海智光器具記器公司）、BS210S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.3 供試菌種及培養(yǎng)基

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，均由廣東微生物研究所實(shí)驗(yàn)室保存；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨8.5 g，氯化鈉 3.5 g，蒸餾水1000mL，pH 7.4。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)工藝流程

新鮮骨頭→粗碎→熬煮→去渣、去油→酶解→高溫滅活→過濾→噴霧干燥→成品→理化檢測→細(xì)菌培養(yǎng)。

1.4.2 檢測方法

游離氨基酸含量測定：甲醛滴定法，采用參考文獻(xiàn)[1]方法；總氮含量測定：凱氏定氮法，采用參考文獻(xiàn)[2]方法；蛋白胨含量測定：酸溶性蛋白檢測法，采用參考文獻(xiàn)[3]方法；氨基酸含量檢測：氨基酸檢測法采用參考文獻(xiàn)[4]方法；水分含量測定：105℃恒重法，采用參考文獻(xiàn)[5]方法；灰分的測定：采用參考文獻(xiàn)[1]方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 骨頭蒸煮熬制方法選擇

新鮮牛骨原料中蛋白質(zhì)含量約14.27%、脂肪28.55%、鈣14.01%、水分20.9%，骨頭熬制是提取骨蛋白的重要操作，骨湯蛋白含量影響著生產(chǎn)的收率及產(chǎn)品的質(zhì)量。試驗(yàn)設(shè)定不同熬制方式進(jìn)行（表1），以骨湯總蛋白含量和游離氨基酸為指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1和圖2。

綜合總氮含量（圖1）和游離氨基酸含量（圖2）來看，方法5的蒸煮方法整體效果更好，可為后面水解提高游離氨基酸含量提供重要幫助，該蒸煮工藝的游離氨基酸含量已經(jīng)接近常規(guī)蛋白胨產(chǎn)品（游離氨基酸含量≥2.0%）要求，對后續(xù)生產(chǎn)成本用酶成本及水解耗能耗時(shí)成本的縮減提供了重要幫助。

表1 骨頭熬制條件

圖1 不同骨頭熬制方法總氮含量對比圖

2.2 蛋白酶的篩選

采用蛋白酶、胰酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶分別水解處理牛骨湯，結(jié)果見圖3。從試驗(yàn)可以看出，復(fù)合蛋白酶的作用較強(qiáng)，水解6h后，游離氨基酸達(dá)到3.26%，其次為胰酶，游離氨基酸含量2.75%，木瓜酶水解能力最低，游離氨基酸2.0%左右。原因復(fù)合蛋白酶中多種酶系，可以同時(shí)對蛋白質(zhì)肽鏈不同位點(diǎn)進(jìn)行剪切，使其快速被分解成小肽及氨基酸。本文進(jìn)一步研究復(fù)合蛋白酶的使用工藝條件等。

圖2 不同骨頭熬制方法游離氨基酸含量對比

2.3 復(fù)合蛋白酶使用工藝條件研究

2.3.1 酶解添加量

由圖4可知，隨著復(fù)合酶用量的增大，產(chǎn)品游離氨基酸含量逐漸增加，但當(dāng)復(fù)合酶用量達(dá)到0.4%（底物量計(jì)）時(shí)，產(chǎn)品游離氨基酸含量基本達(dá)到最高點(diǎn)3.8%，再繼續(xù)增加酶的用量，游離氨基酸含量提高的幅度不大，基本平穩(wěn)。因此，綜合生產(chǎn)成本考慮，建議生產(chǎn)用酶，添加量為0.4%（底物量計(jì)）即可。

圖3 不同酶的酶解能力對比

圖4 復(fù)合酶不同用量對游離氨基酸含量的影響

2.3.2 酶解時(shí)間

從圖5數(shù)據(jù)得知，隨著酶解時(shí)間的延長，游離氨基酸含量逐漸增加，當(dāng)水解時(shí)間達(dá)到16h后，游離氨基酸含量達(dá)到最高值4.38%，再往后延長時(shí)間水解，游離氨基酸也基本平穩(wěn)。從生產(chǎn)成本考慮，建議生產(chǎn)時(shí)間為16h。

圖5 復(fù)合酶不同水解時(shí)間游離氨基酸含量效果對比

2.3.3 酶解pH值

復(fù)合酶是多種不同酶復(fù)合在一起使用的，各個(gè)酶的最佳作用pH值不同，因此，需要重新找到一個(gè)適合該酶用的最佳pH值范圍。從圖6可以看出，新鮮牛骨湯pH為中性7.5左右，加蛋白酶水解0.5h后，蛋白酶迅速將蛋白肽鏈末端切斷成氨基酸，水解物中氨基酸含量高致使pH下降，pH值迅速下降至6.0左右后趨于平穩(wěn)狀態(tài)。因此，生產(chǎn)水解過程中前3h需要時(shí)刻關(guān)注調(diào)整pH值。

圖6 復(fù)合酶不同PH值水解對游離氨基酸含量效果對比

2.4 骨蛋白胨酶解產(chǎn)品氨基酸結(jié)果分析

將新鮮骨頭按照工藝“骨頭1∶2加水→加復(fù)合蛋白酶→55℃酶解1h→0.2MPa壓6h→過濾→取清湯濃縮至12%濃度→加復(fù)合蛋白酶0.4%（湯量計(jì)）→55℃水解16h，控制pH6.5→高溫滅活→過濾→噴霧干燥（或冷凍干燥）→成品”生產(chǎn)出來的產(chǎn)品進(jìn)行氨基酸成分對比分析，結(jié)果如表2所示。

牛骨湯原料酶解前各類游離氨基酸含量都很低，總游離氨基酸僅0.727%，水解后各組分氨基酸成倍增長，谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸等明顯增加，總游離氨基酸含量達(dá)到4.329%。酶解后，游離氨基酸相對提高5倍左右。而從水解氨基酸含量來看，總氨基酸含量占比80.55%，同時(shí)色氨酸≥1.0%，肽鏈中大部分氨基酸已經(jīng)被暴露在外邊，說明蛋白分子已經(jīng)基本被分解成小肽和氨基酸。

表2 復(fù)合酶水解前后氨基酸成分分析對比

2.5 蛋白胨產(chǎn)品理化指標(biāo)及培養(yǎng)細(xì)菌生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 骨蛋白胨產(chǎn)品理化指標(biāo)

骨蛋白胨產(chǎn)品理化指標(biāo)檢測結(jié)果見表3，符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.5.2 不同蛋白胨培養(yǎng)細(xì)菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用其對比市售的高優(yōu)質(zhì)胰蛋白胨產(chǎn)品培養(yǎng)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌兩種菌體。如圖7、圖8所示，兩種菌在各測試培養(yǎng)基中的生長趨勢相似，在試驗(yàn)中沒有觀察到生長延滯期，細(xì)菌從接入培養(yǎng)基后即進(jìn)入指數(shù)生長期，隨后是生長穩(wěn)定期，枯草芽孢桿菌的生長峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)36 h左右，而金黃色葡萄球菌長最高點(diǎn)出現(xiàn)在培養(yǎng)24h。兩種細(xì)菌都是在骨蛋白胨的培養(yǎng)基中生長較好，高峰期OD600值相對市售的胰蛋白胨分別提高21%及26%左右，這說明該骨蛋白胨能夠較好地提供細(xì)菌生長所需要的氮源營養(yǎng)。

表3 蛋白胨理化指標(biāo)檢測結(jié)果

圖7 不同培養(yǎng)基中枯草芽孢桿菌的生長曲線

圖8 不同培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的生長曲線

3 結(jié)論

牛骨通過復(fù)合蛋白酶處理后可生產(chǎn)高質(zhì)量的蛋白胨，牛骨先通過蛋白酶水解后，高溫高壓（0.2MPa）蒸煮6h，取骨湯濃縮至15%濃度，按液重計(jì)加復(fù)合蛋白酶0.4%，55℃水解16h，控制pH6.5，酶解液通過過濾噴霧干燥后所得產(chǎn)品游離氨基酸4.329%、總氮14.86%、水分3.4%、灰分3.7%、pH6.5，水解氨基酸80.55%。其產(chǎn)品作為培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌比市售的胰蛋白胨產(chǎn)品OD600值高20%以上。因此，本酶解工藝具有水解時(shí)間短、操作條件溫和、成本低，產(chǎn)品總氮與生物性好等優(yōu)點(diǎn)，有利于高品質(zhì)骨蛋白胨的研發(fā)與應(yīng)用，可推廣到實(shí)際生產(chǎn)。