人外周血單個核細胞分離優(yōu)化

李飛，潘妍，張建平＊

（1.臺州學院，浙江臺州 318000；2.臺州市耶大基因與細胞治療研究院，浙江臺州 318000）

人們不斷深入研究腫瘤的治療措施，免疫細胞療法被逐漸廣泛應用。外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMC）通過富集外周血干細胞來治療免疫缺陷疾病、代謝性遺傳疾病、惡性血液病等疾病[1]。PBMC包括B細胞、T細胞、單核細胞和NK細胞等，對于評價免疫反應起到非常重要的作用[2]。目前，相關PBMC分離優(yōu)化的文獻相對不多，本文通過研究PBMC分離優(yōu)化條件，提高細胞的分離率與收集率，在一定程度上減少分離時間和原料，提高細胞獲得率與純度，為臨床與基礎細胞學研究提供一個較為有效的細胞獲取途徑以便后續(xù)免疫細胞實驗。本文提取PBMC通過ficoll密度梯度離心法，從離心和洗滌兩個方面探究人外周血干細胞最佳分離條件。

1 材料

1.1 材料來源

血液來自成年獻血者，其年齡為20～30歲，身高160～180 cm，體重50～80 kg，獻血者在采集期間身體健康，無感冒等生病跡象。

1.2 主要設備與試劑

生物安全柜（1374，Thermo）、高速冷凍離心機（ST16R，Thermo）、細胞計數(shù)儀（Vi-CELL XR，Beckman Coulter）。

人全血單個核細胞分離液（LDS1076，TBD）磷酸鹽緩沖液（PBS）（311-010-CL，WISENT INC）、hanks液（HBSS）（AC13716284，HyCIoneTM）。

2 方法

2.1 采集與運輸

將止血帶綁于手臂上臂，用碘伏對皮膚進行消毒，將采血針穿刺進靜脈，另一端連接采血管。妥善固定針頭。采血結束后，靜脈穿刺局部以無菌棉球按壓5min，同時移除針頭，另一端也移出采血管。平緩搖動采血管，使血液與抗凝劑混勻。

在采血管外貼上標簽，注明姓名等信息。核對信息正確后將外周血瓶及采集的臍血血樣放入專門運輸箱，嚴禁X線照射（安檢），盡快送達干細胞庫，時間不超過24h。

2.2 PBMC分離

2.2.1 分離離心

統(tǒng)一在溫度20 ℃、濕度50%RH的細胞實驗室進行試驗，使用15 mL離心管，取一支離心管將1 mL外周血與等體積稀釋劑（洗滌劑）混勻，加到另一支裝有梯度體積的Ficoll（分離液）的離心管中，緩慢地加到Ficoll液面上。進行梯度離心。

2.2.2 洗滌離心

分離離心后，吸取離心管內(nèi)白膜層轉移至另一支離心管內(nèi)，加洗滌劑至12mL，振蕩混勻，離心（1 500 r/min，10 min，升9降9）。棄上清，保留2mL洗滌劑重懸細胞進行細胞計數(shù)。

2.3 不同離心力轉速、時間、升降因素

采用三因素三水平列正交表（表1），進行離心因素實驗。按梯度進行分離離心后采用進行洗滌離心吸取離心管內(nèi)白膜層轉移至另一支離心管內(nèi)，加洗滌劑（0.9%的生理鹽水）至12mL，振蕩混勻，離心（1500r/min，10min，升9降9）。棄上清，保留2mL洗滌劑重懸細胞利用細胞計數(shù)進行細胞計數(shù)。

表1 離心力轉速、時間、升降速度三因素正交試驗設計表

2.4 不同分離液體積、洗滌液體積、洗滌次數(shù)因素

采用三因素三水平列正交表（表2），進行洗滌因素實驗。分離離心（600g、30min、升9降0）后，洗滌劑為0.9%的生理鹽水，進行正交試驗。

表2 分離液體積、洗滌液體積、洗滌次數(shù)三因素正交試驗設計表

2.5 不同緩沖液（洗滌劑）因素

分別使用PBS、HBSS、0.9%的生理鹽水進行分離離心（600g、20min、升9降0），洗滌離心（1 500 r/min，10min，升9降9）。棄上清，保留2mL洗滌劑重懸細胞利用細胞計數(shù)進行細胞計數(shù)。

2.6 數(shù)據(jù)處理

正交表實驗采用正交設計助手II v3.1分析實驗數(shù)據(jù)，采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)采用+s表示，組間數(shù)據(jù)采用t檢驗，組內(nèi)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05差異具有顯著意義。

3 結果與分析

3.1 離心因素分離PBMC的活細胞數(shù)量

首先通過方差分析進行F檢驗，差異不顯著，無統(tǒng)計學意義。然后進行直觀分析，如表3，極差排序為離心轉速＞離心時間＞離心升降，離心轉速極差最大，為主要影響因素。實驗指標越大越好，查看均值水平對應實驗指標，確定該正交實驗的最優(yōu)水平組合離心轉速應為600g。

表3 離心因素實驗分離PBMC的活細胞數(shù)量（×106/mL）

3.2 洗滌因素分離PBMC的活細胞數(shù)量

首先通過方差分析進行F檢驗，F(xiàn)icoll體積在給定顯著性水平α=0.10中，F(xiàn)比=3.462＞F臨=3.110差異一般顯著。然后進行直觀分析，如表4，極差排序為Ficoll體積＞洗滌次數(shù)＞洗滌液體積，F(xiàn)icoll體積極差最大，為主要影響因素。實驗指標越大越好，查看均值水平對應實驗指標，確定該正交實驗的最優(yōu)水平組合Ficoll體積應為2mL。

表4 洗滌因素實驗分離PBMC的活細胞數(shù)量（×106/mL）

3.3 緩沖液因素分離PBMC的活細胞數(shù)量和活率

通過密度梯度離心法原理，三者緩沖液中0.9%的生理鹽水溶液的密度最小，假設其獲得細胞數(shù)量最多。通過數(shù)據(jù)分析如表5可知，使用PBS、HBSS緩沖液時，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。使用0.9%的生理鹽水緩沖液分離PBMC的活細胞數(shù)量最多和活率最大。

表5 緩沖液因素分離PBMC的活細胞數(shù)量和活率

4 結論

外周血單個核細胞在艾滋病、肝炎等傳染病樣本資源庫作為儲存的重要樣本。其采集具有安全性高、痛苦性小、無需麻醉、自身血小板和粒細胞恢復快等特點，有助于更好的治療患者[3]。通過研究PBMC分離優(yōu)化條件，提高細胞的分離率與收集率，針對工藝化方面提高采集效率及產(chǎn)品純度有重要意義。

該實驗通過從分離離心方面考慮離心機轉速、時間、升降三因素，比較活細胞數(shù)量發(fā)現(xiàn)離心機轉速因素影響較大，600g，30min，升9降0可為分離1mL原血PBMC的初步最適條件；從洗滌收集方面考慮分離液體積，洗滌液體積，洗滌次數(shù)三因素，比較活細胞數(shù)量發(fā)現(xiàn)2倍分離液體積，8倍洗滌體積，1次洗滌為初步最適條件；從洗滌離心收集方面考慮緩沖液的影響，發(fā)現(xiàn)0.9%的生理鹽水其活細胞濃度最高。基于上述結論，可以根據(jù)實驗儀器、試劑等條件，調整優(yōu)化來滿足實驗需求，分離出更有活力、更多的PBMC。