基于納米金屬-有機骨架UiO-66的Hg(Ⅱ)熒光生物傳感器的設計

覃亮，徐境榮，黃煥，李樹梅，羅楚敏

（肇慶學院食品與制藥工程學院，廣東肇慶 526061）

汞（Hg）是一種劇毒非必需元素，具備難降解、易富集的特征，是在生態系統中能完善循環的惟一重金屬[1]。2017年10月27日，在世界衛生組織國際癌癥研究機構公布的致癌物清單中，汞和無機汞化合物在3類致癌物清單中。

研究發現，汞離子（Hg2+）可以和核酸分子中的胸腺嘧啶（T）發生特異性結合，形成T-Hg2+-T鍵的復合物，可以顯著提高T-T錯配的穩定性[2]。2011年，Liu的科研團隊首次設計出基于氧化石墨烯（Grapheneoxide，GO）的DNA熒光傳感器[3]。雖然基于GO的熒光傳感器較傳統的Hg2+檢測法表現出靈敏度高、檢出限低、選擇性好、操作簡單等優點，但受限于材料生產，存在價格較高的問題[4]。

UiO-66是2008年由挪威奧斯陸大學研究開發的一種基于Zr的金屬-有機骨架材料[5]，該材料不但具有GO的性能，而且具有合成方法溫和、可控性高、孔洞大小可調節的優勢，在氣體分離、磁共振成像、生物醫藥、化學傳感器等方面具有潛在的應用價值[6-7]。到目前為止，基于UiO-66的Hg2+熒光傳感器的研究還尚未見報道。因此，本實驗將UiO-66應用于水溶液中Hg2+熒光傳感檢測技術中，有利于更好地開展新型的檢測方法的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

本實驗所用四氯化鋯，對苯二甲酸，苯甲酸，N,N-二甲基甲酰胺，無水乙醇均購于上海麥克林生化科技有限公司，實驗所用探針DNA（Probe DNA，P-DNA）片段購自Sangon公司，其中P-DNA以6-羧基熒光素（6-FAM）作為熒光標記物，具體序列如下：

P-DNA： 5' -FAM-TTCTTCTTCGCGTTGTT-3'

D8 ADVANCE X射線衍射儀（德國布魯克公司）、DTG-60H差熱-熱重聯用儀（日本島津公司）、JEM-2100F場發射透射電鏡儀（日本電子株式會社）、F-7000熒光分光光度計（株式會社日立制作所）。

1.2 UiO-66的合成方法及其表征

1.2.1 UiO-66的合成與純化

將四氯化鋯(ZrCl4)（3.0083 g，0.0129mol），對苯二甲酸（2.1431 g,0.0129mol）和苯甲酸（31.4463 g,0.2575mol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）（170 mL，1.030mol）并置于燒杯中，超聲30 min至完全溶解；轉移至250 mL聚四氯乙烯內襯的不銹鋼反應釜中，120℃反應24 h。得到乳白色混懸液，離心，得白色沉淀；依次加入適量的DMF，無水乙醇各洗滌沉淀物3次，自然干燥后得UiO-66。

1.2.2 場發射透射電鏡（FESEM）分析

取干燥的UiO-66置于場發射環境掃描電鏡儀的樣品臺中，觀察晶體的表面形貌。

1.2.3 X-射線衍射（XRD）分析

設置管壓為40 kV，電流為40 mA，在2θ為5o～60o范圍內進行掃描，掃描速度為5o/min。完成數據收集后，使用Origin分析軟件將X射線譜圖與標準卡片比對，以確定UiO-66是否成功合成。

1.3 UiO-66結合P-DNA的熒光淬滅性能

將2 mL P-DNA的水溶液（含1 μL500μmol/L P-DNA）置于熒光比色皿中，作為待滴定液；將UiO-66混懸配成500 μmol/L（含500μmol/LP-DNA）的溶液為滴定液。將滴定液按體積梯度加入比色皿中，記錄體系熒光強度的變化（λex=480 nm）直到熒光淬滅達到飽和，此時得到的復合體系為P-DNA@UiO-66。熒光淬滅效率QE用公式（1）計算。

其中，F0為P-DNA初始熒光強度；FM為加入UiO-66后體系熒光淬滅達到飽和時的熒光強度。

1.4 P-DNA@UiO-66對Hg2+的熒光復蘇性能

在上述實驗基礎上，將稀釋后的Hg2+溶液加入到熒光淬滅達到飽和的P-DNA@UiO-66復合體系中，監測熒光強度隨時間的變化，確定體系熒光復蘇達到飽和時的熒光強度。熒光復蘇效率RE用公式（2）計算。

其中，FT為加入Hg2+后復蘇達到飽和時的熒光強度。

1.5 熒光各向異性（FA）測定

為了進一步證明化合物與P-DNA之間存在相互作用，設定激發波長為480 nm，測定P-DNA，P-DNA@UiO-66體系，P-DNA@UiO-66+Hg2+體系，P-DNA@Hg2+體系的熒光各向異性值。

2 結果與分析

2.1 UiO-66的FESEM分析

通過場發射環境掃描電鏡儀，觀察到制備的納米級UiO-66大小均勻，具有良好的分散性，如圖1所示。

圖1 本實驗制備的UiO-66的FETEM圖

2.2 XRD分析

實驗結果表明，合成的UiO-66的整體峰型與模擬的UiO-66 XRD衍射峰的位置一致（圖2），說明UiO-66晶體制備成功，而且純度較高。

圖2 本實驗制備的UiO-66的XRD圖

2.3 P-DNA@UiO-66的熒光淬滅性能分析

通過熒光滴定實驗，考察了UiO-66對P-DNA的熒光淬滅效果，實驗結果如圖3所示。

圖3 UiO-66的淬滅曲線組合圖

通過圖3可得知，隨著UiO-66懸濁液的加入，P-DNA的熒光強度逐漸減弱。當UiO-66溶液加入的濃度約為15.5μmol/L時，P-DNA的熒光淬滅程度達到飽和。

2.4 Hg2+對P-DNA@UiO-66的熒光復蘇性能分析

通過熒光復蘇實驗，考察了Hg2+對P-DNA@UiO-66的熒光復蘇效果，可以觀察到體系的熒光強度緩慢復蘇，實驗結果如圖4所示。當Hg2+濃度約為100 μmol/L時，P-DNA@UiO-66體系的熒光復蘇強度達到飽和，熒光強度不再發生變化。實驗結果表明，P-DNA@UiO-66體系對Hg2+具有有效的檢測能力。

圖4 熒光復蘇曲線組合圖

2.5 熒光各向異性測定結果分析

通過熒光各向異性實驗，考察了P-DNA、P-DNA+MOF（金屬有機骨架）、P-DNA+MOF+Hg2+的熒光各向異性值（FA），實驗結果如圖5所示。在未加入UiO-66前，P-DNA的FA約為0.078，加入UiO-66后，P+MOF的FA約為0.206，是單獨P-DNA存在時的2.64倍。加入Hg2+后，體系FA下降為0.118。

圖5 熒光各向異性圖

圖6 UiO-66在不同環境中的XRD圖

從圖6可知，UiO-66具有高度的穩定性，因此我們推測其作用機理可能是Hg2+加入后，P-DNA與Hg2+通過親和作用形成T-Hg2+-T的類似雙鏈結構。由于雙鏈結構與UiO-66表面的親和力較弱，可以從UiO-66表面游離出來，體系熒光強度上升，其作用機理見如圖7所示。

圖7 基于UiO-66的Hg2+熒光傳感器原理圖

3 結論

本文以UiO-66為基礎制造Hg2+的熒光生物傳感器，研究其復合體系的熒光淬滅和熒光復蘇的性能。UiO-66對P-DNA有良好的淬滅效果，當Hg2+存在時，體系熒光強度上升，表明P-DNA@UiO-66體系對Hg2+具有有效的檢測能力。