豬圓環三型病毒抗原蛋白表達體系的優化探究

吳凡，梅嘯，吳鳳亭

（蘇州工業園區服務外包職業學院，江蘇蘇州 215123）

豬圓環病毒（Porcine circovirus，PCV）是一種共價閉合、單股環狀DNA病毒。2015年，從美國北卡羅來納州某豬場爆發的PDNS疫情中鑒定出一種新病毒，該病毒與圓環病毒科病毒具有類似基因組結構和遺傳相似性，但與其他圓環病毒衣殼蛋白氨基酸序列同源性低于70%，將其歸類為一種新型圓環病毒，命名為PCV3[1-2]。該病毒能引起豬的多系統炎癥反應，若沒有有效地控制方法，會對養豬產業帶來災難性的經濟損失，同時對人類健康也有潛在風險[3-4]。因此針對這種新型PCV3病毒，疫苗的研究工作尤為重要。本實驗作為相關疫苗研究工作的基礎，主要對PCV3病毒進行序列優化后建立表達載體，對抗原蛋白發酵表達的條件進行探索，希望能夠找到最優發酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

氯化鈉、氨水、鹽酸為國藥分析純，自配；蛋白胨、酵母浸粉，購自安琪酵母股份有限公司；無水乙醇，購自Macklin公司。

1.1.2 實驗對象

基因序列優化后的PCV3病毒。

1.1.3 主要設備

高速離心機（Thermo Scientific）、細胞均質機（AVESTIN）、高壓滅菌鍋（上海博迅）、凝膠成像儀（Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 基因序列優化及表達載體構建

將PCV3基因序列的N端截去4個氨基酸達到最優序列，通過BamH1與Nco1兩個酶切位點把優化后的PCV3序列構建到帶有his標簽的pET28b載體上。

1.2.2 搖瓶培養表達目的蛋白

（1）細胞轉化。BL21細胞復蘇后，加入pET28b-PCV3質粒進行轉染，再加入500μL普通培養基培養1 h后，離心1 min，吸取上清液，離心管內沉淀加入BufferZ重懸，菌液涂抹在含有kan（卡那霉素）抗性的平板上，37℃過夜培養。

（2）搖瓶表達。從平板上挑取單克隆菌落放入100mL單抗（kan）培養基，稀釋混勻后吸取10mL的菌液放入含有500mL的LB培養基和500μL的kan培養基的搖瓶中，分為三組，每組8個搖瓶。每組培養條件如表1。

表1 各組搖瓶表達條件

培養過程中，在加入誘導劑異丙基硫代半乳糖苷IPTG之前先檢測菌液渾濁度（OD600值），達到要求后，每組按照表1加入IPTG誘導劑，按照各組搖菌條件培養過夜，讓細菌充分進行蛋白表達后，利用破碎機將菌液破碎離心，棄去上清液，沉淀用Buffer Z重懸，放置在冰箱備用。

（3）發酵罐罐內滅菌鏡檢后，加入種子液與卡那霉素、加氯霉素發酵后，設置罐內培養參數，培養過程中，每過一小時監測一次OD600的值，誘導12 h。

1.2.3 發酵罐培養表達目的蛋白

（1）種子液準備。將轉化好的細菌接種在含有卡那霉素 ＆ 氯霉素雙抗平板上培養，37℃恒溫培養24 h，挑取單菌落接種在含有5mL的雙抗LB培養基中，37℃、250r/min搖床條件下，培養5～6h，作為一級種子液。再從一級種子液中吸取20μL培養基加入500mL的雙抗培養基中，37℃、220r/min條件下培養過夜。

（2）發酵罐準備。發酵罐使用前罐內滅菌鏡檢，合格后按1∶4（磷酸∶氨水）的比例配制1000mL的溶液，在超凈臺上分裝入小發酵罐，同時每個發酵罐內加入1‰的卡那霉素 ＆ 氯霉素；罐內通氣量設為4m3/h，保持罐內正壓，200r/min攪拌速度，溫度37℃，打開蠕動泵，pH調至6.95～7.05。

（3）接種。種子液混勻加入發酵罐，發酵條件穩定在通氣量4m3/h，罐壓0.04～0.05MPa，轉速200r/min。數值穩定10min后標定溶氧電極，做好標記。當OD600值達到20～25時，降溫至28℃，溫度穩定后30 min，快速加入IPTG（罐內溶液體積的1‰），滅菌密封，誘導12 h。期間監測OD600數據，觀測罐內氣泡及酸堿值。

1.2.4 細菌破碎純化

將搖瓶表達的菌液與發酵菌液分別取出并進行細胞破碎，依次通過Q柱、Butyl柱純化，用不同濃度的洗脫液洗脫雜蛋白，分別收集洗脫后的樣品以備后期電泳。

1.2.5 SDS-PAGE凝膠電泳驗證表達蛋白量

配好膠后，將每組樣品加入適量LoadingBuffer，點樣后將膠體放入電泳槽，220V電壓下跑膠30 min左右。

2 結果與分析

本實驗需要關注的3種表達蛋白分別為52kD、49kD和41kD大小，根據誘導劑加入量不同、OD600值不同分為以下3種情況。

2.1 OD600為0.6、IPTG500μL條件下

如圖1所示，不同洗脫條件下洗出的蛋白和雜蛋白大小及數量各不相同，在條帶8、9中，在洗脫液為100%0.5mol/LNaCl imidazole的條件下，目標蛋白52kD、41kD和49kD處有明顯的蛋白表達，49kD的表達量相對較高，但兩條條帶中，3種蛋白表達量并不均一，分子量大的表達量也較大。

圖1 PCV3蛋白表達結果（OD600值0.6、IPTG500μL條件下）

2.2 OD600值為1.0、IPTG500μL條件下

如圖2所示，3% 0.5mol/LNaCl imidazole洗脫液中已有目標蛋白的表達，但同時雜蛋白也較多，無法區分；在100%洗脫（條帶5、6）時，3種表達蛋白有更明確的表達，雜蛋白表達量減少，并且在同等條件下，條帶6上樣量較多，3種蛋白表達量也增多。與第1組相比，改變菌液濁度（OD600從0.6提高到1.0）后3種蛋白都有較均一的表達量，但整體3種蛋白的表達量沒有第1組高。

2.3 OD600值為1.0、IPTG100μL條件下

在本組條件中，菌液濁度不變，誘導劑IPTG加入的量減少到100μL，41kD、49kD與52kD3種蛋白表達量相較于前兩個條件有所增加，同樣在100%洗脫條件下的跑膠圖顯示的3種蛋白表達濃度最清晰，相互之間的表達量也較為均一，洗脫的雜蛋白的量減少，如圖3所示。

圖2 PCV3蛋白表達結果（OD600值1.0、IPTG500μL條件下）

圖3 PCV3表達蛋白結果（OD600值1.0、IPTG100μL條件下）

2.4 發酵罐菌液跑膠圖

圖4可見，上樣量為5μL的條帶相較于上樣量為2μL的條帶在同樣大小的蛋白處表達更高，在41kD、49kD和52kD3種蛋白大小處，條帶1和5表達均一，濃度較低；條帶2、3、4表達的蛋白濃度更高，均一度依然保持一致。

圖4 發酵罐菌液跑膠表達圖

3 結論

通過本實驗中的搖瓶表達條件改變，發現在不同的菌液渾濁度下，加入不同量的IPTG都會影響到最后PCV3抗原蛋白的表達，當OD600為1.0、加入IPTG溶液100μL時，PCV3病毒蛋白表達量相對最高，表達效果也最均一。以往認為在OD600為1.0、IPTG溶液加入500μL時蛋白的表達量是較好的，但經過本次探究發現，IPTG溶液的加入量為100μL時，PCV3病毒蛋白的表達反而更多。

目前的PCV3疫苗還處于研究階段，經過不斷嘗試但還達不到很好的效果，對PCV3病毒蛋白的表達大多是用搖瓶和小發酵罐進行生產研究，本研究提供了在優化的條件下快速安全的進行PCV3病毒蛋白的大量表達，為PCV3病毒疫苗的研究提供更好的基礎。