柳枝稷TIFY基因家族的鑒定與分析

趙曉曉，謝坤良，張舒夢，張 超，奚亞軍，孫風麗

(西北農林科技大學農學院，陜西 楊凌 712100)

TIFY基因家族是植物中特有的轉錄因子超家族，因含有高度保守的TIF [F/Y]XG氨基酸序列而得名，依據結構特點及進化關系分為TIFY，PPD，ZIM/ZML(ZIM-like)，JAZ四個亞家族[1-2]。TIFY家族成員可調控多種生長發育過程及脅迫防御反應：牽牛花(Pharbitisnil)的PnFL-2蛋白[3]含有TIFY家族典型的TIFY與CCT域，可能在花誘導中發揮作用；過表達水稻(Oryzasativa)OsTIFY11b[4]使得莖稈積累了更多的碳水化合物，進而促進種子大小與粒重增加；香蕉(Musaacuminate)MaTIFY1b[5]參與果實的成熟；擬南芥(Arabidopsisthaliana)PPD2[6]與NINJA共同調節葉片整齊度；野大豆(Glycinesoja)GsTIFY[7]參與碳酸氫鹽脅迫反應；毛竹(Phyllostachysedulis)PeTIFY[8]在脫水及冷脅迫中起作用；木豆(Cajanuscajan) CcTIFY[9]調控植株在銅脅迫下的響應。TIFY基因家族全基因組分析自擬南芥[1]、水稻[10]、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)[11]等模式作物以后，已分別在雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)[12]、玉米(Zeamays)[13]、小麥(Triticumaestivum)[14]等植物中相繼報道。

JAZ蛋白(JAZs)隸屬TIFY基因家族的JAZ亞家族，是茉莉酸(jasmonic acid，JA)信號通路的轉錄抑制因子[15]。JAZs不含DNA結合結構域，必須依賴蛋白間的互作行使功能[1]：JAZ蛋白N末端弱保守的NT結構域可與DELLA蛋白互作[16]，DELLAs主要作用是抑制赤霉素(gibberellin，GA)信號傳遞，兩者的互作使得JA與GA信號通路聯系起來，調控植物的生長-防御平衡；ZIM結構域保守的TIFY基序是JAZs形成同源或異源二聚物的基礎[17]，ZIM結構域與NINJA和TPL阻遏蛋白的互作抑制了JA信號通路中MYC轉錄因子的活性[18]，JA應答基因的表達被關閉；JAZ蛋白C末端的Jas結構域十分保守，可與EIN3、EIL1[19]等轉錄因子互作，使得JA信號通路與乙烯(ethylene，Eth)信號通路交聯，進而調控植株的發育及抗病性。研究報道JA介導的JAZs轉錄水平的變化與生長素(auxin，IAA)、Eth，GA及油菜素內脂(brassinolide，BRs)等激素信號的調節相關，這些激素形成復雜的調控網絡，在植物的生長發育、激素應答及脅迫響應等方面發揮作用[20]。

柳枝稷(PanicumvirgatumL.)為禾本科黍屬多年生C4草本植物，因具有生物質產量大、纖維素含量高、抗逆性強、可在邊際土地生長、水肥需求少、對環境友好等優點，成為國際上公認的模式能源作物[21-22]，TIFY基因家族具有多種的生物學功能，但在柳枝稷中尚未開展相關研究。本研究鑒定了柳枝稷基因組中的TIFY家族成員，并對其染色體定位、進化關系、基因結構、保守基序組成、啟動子區順式作用元件及時空表達模式等生物信息進行了分析，且通過定量實驗驗證了部分成員的激素應答及脅迫響應特性，從而為揭示TIFY基因家族在柳枝稷中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 柳枝稷TIFY基因家族的鑒定

從JGI數據庫(http://jgi.doe.gov/)下載柳枝稷蛋白數據，同時在Pfam數據庫(http://pfam.xfam.org/)提取TIFY(PF06200)的隱馬爾科夫模型矩陣文件，然后利用HMMER搜索含有TIFY保守結構域的柳枝稷蛋白序列并通過結構域可視化及序列多重比對等方法再次確認其結構域是否完整，最終得到柳枝稷TIFY基因家族成員。

1.2 柳枝稷TIFY基因家族的分析

TIFY系統進化分析：將擬南芥AtTIFY[1]、水稻OsTIFY[10]及篩選到的柳枝稷TIFY蛋白序列提交到MEGA5.0進行序列多重比對，然后采用NJ(Neighbor-Joining)法繪制種間進化樹，設定自舉值為1000；

柳枝稷TIFY染色體定位分析：從JGI數據庫(http://jgi.doe.gov/)下載的基因組數據中提取基因位置信息，結合柳枝稷染色體數目及長度等信息，利用MapDraw軟件繪制基因的染色體定位圖譜；

柳枝稷TIFY種內進化分析：將柳枝稷TIFY蛋白序列經MEGA5.0多重比對后采用NJ法繪制進化樹，自舉值1 000；

柳枝稷TIFY基因結構分析：將柳枝稷TIFY家族成員的CDS序列及Genomics序列提交至GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/indx.php)在線軟件，對每個成員的外顯子與內含子分布情況進行分析；

柳枝稷TIFY保守基序分析：將柳枝稷TIFY蛋白序列提交至MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)，設定搜索motif的個數為6，其它選項為默認參數；

柳枝稷TIFY啟動子區順式作用元件分析：從JGI數據庫(http://jgi.doe.gov/)提取基因上游2000bp片段，提交至PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)。

柳枝稷TIFY時空表達模式分析：從JGI數據庫(http://jgi.doe.gov/)獲得各基因在不同組織的表達量數據，使用HemI軟件制作組織特異性表達圖譜。

1.3 部分成員的表達特性分析

植物材料及處理：挑選籽粒飽滿、大小均勻的柳枝稷低地型品種“Alamo”種子，先后使用70%無水乙醇表面消毒1 min，10%次氯酸鈉溶液滅菌5 min，然后使用無菌水沖洗3～4次，置于4℃條件下過夜，次日將處理過的種子置于帶有濾紙的培養皿上，于27℃(16 h/8 h)光照培養箱中生長。待幼苗根長2 cm左右時，轉移至水培容器內繼續在光照培養箱內培養，每隔2～3 d換一次培養液，水培3周后用于激素與脅迫處理。激素處理參照水稻幼苗處理方式[10]，脅迫處理參照二穗短柄草幼苗處理方式[11]。取材部位為葉片，經液氮處理后于—80℃保存。

RNA提取及熒光定量PCR：利用RNAiso Plus提取上述材料總RNA，參照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說明書進行反轉錄，使用Primer Premier 6.0設計基因特異引物；按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)說明書配置熒光定量PCR體系10 μl；使用QuantStudioTM3 Flex Real-Time PCR System進行PCR反應，兩步法；利用SigmaPlot12.5軟件處理數據、制作圖表，相對表達量以2-△△CT法計算。引物序列如表1所示。

表1 熒光定量PCR引物列表

注：PviTIFY10aF與PviTIFY10aR同時擴增PviTIFY10e，PviTIFY10f與PviTIFY10a基因；PviTIFY10bF與PviTIFY10bR同時擴增PviTIFY10g，PviTIFY10h與PviTIFY10b基因；EF-1-alpha為柳枝稷實時熒光定量PCR的內參基因[23]

Note:PviTIFY10aFandPviTIFY10aRsimultaneously amplifiedPviTIFY10e,PviTIFY10fandPviTIFY10agenes;PviTIFY10bFandPviTIFY10bRsimultaneously amplifiedPviTIFY10g,PviTIFY10handPviTIFY10bgenes;EF-1-alphawas the internal reference gene of qPCR in switchgrass[23]

2 結果與分析

2.1 柳枝稷TIFY基因家族的鑒定

在柳枝稷基因組中共鑒定到48個TIFY序列，命名為PviTIFY(區別于菜豆(PhaseolusvulgarisL.)的TIFY序列PvTIFY[24])，命名順序參照OsTIFY，分屬ZML(7個)、TIFY(1個)、JAZ(40個)3個亞家族。其基本信息如表2所示，PviTIFY的CDS全長465～1 323 bp不等，編碼蛋白的氨基酸數目154～440個不等，TIFY保守基序呈現多種形式。

2.2 TIFY基因家族的進化分析

將柳枝稷PviTIFY序列、水稻OsTIFY序列及擬南芥AtTIFY序列共計86個蛋白序列進行多重比對后利用MEGA5.0構建進化樹，如圖1所示，TIFY基因家族的4個亞家族成員構成及分布如下，PPD亞家族僅包含雙子葉植物擬南芥的AtTIFY4a與AtTIFY4b；TIFY亞家族包含OsTIFY8、PviTIFY8a與AtTIFY8，但AtTIFY8與其他蛋白序列親緣關系較遠而同PviTIFY8b位于單獨分枝；ZML亞家族由3個物種的TIFY1與TIFY2構成，共計14個成員；剩余其它蛋白序列分屬JAZ亞家族，可分為以下3個類群，JAZⅠ，JAZⅡ，JAZⅢ，其中JAZⅠ僅包含PviTIFY與OsTIFY序列，共計19個；JAZⅡ含有最多的PviTIFY序列，占比為13/22；JAZⅢ包含的TIFY序列數目最多，計25個。

2.3 PviTIFY的染色體定位

依據基因組數據信息，對48個PviTIFY基因進行染色體定位，如圖2所示，除PviTIFY5b與PviTIFY11s位于沒有拼接到染色體的scaffolds上，其余46個PviTIFY分別定位于染色體1，2，4，5，6，7，8，9。在染色體9分布的PviTIFY數目最多，計24個，包含了PviTIFY11中除PviTIFY11s以外的所有成員，且形成了4個基因簇，9K與9N各兩個；其次為染色體2與染色體7，分別含有9個PviTIFY與6個PviTIFY；染色體4與染色體6均含有2個PviTIFY；染色體1N、染色體5K及染色體8K則各含有1個PviTIFY，分別是PviTIFY9c，PviTIFY8b與PviTIFY8a。

表2 柳枝稷TIFY基因家族基本信息

圖1 擬南芥、水稻、柳枝稷中TIFY的系統發育樹

2.4 PviTIFY的結構特點

按照PviTIFY的進化樹順序，分析了各成員的基因結構與保守基序組成，如圖3所示：

PviTIFY10與PviTIFY11位于鄰近的兩個進化枝，含有相同的motif組成，即N-terminal，TIFY，Jas，歸屬JAZ亞家族。在8個PviTIFY10成員中，除PviTIFY10c外，其他PviTIFY10均由5個外顯子與4個內含子組成，與PviTIFY10位于同一進化枝的PviTIFY11c，PviTIFY11d，PviTIFY11g，PviTIFY11j，PviTIFY11k，基因結構由3個外顯子與2個內含子構成，而位于其鄰近進化枝的剩余PviTIFY11成員均不含內含子。結合進化關系與結構特點將以上成員分屬JAZⅠ組與JAZⅡ組。

PviTIFY3，PviTIFY5，PviTIFY6，PviTIFY9及PviTIFY8b雖位于不同進化枝，但保守基序均由TIFY motif與Jas motif組成，同屬JAZ亞家族。其中PviTIFY6的外顯子與內含子數目最多，含有7個外顯子與6個內含子(PviTIFY6c含有6個外顯子與5個內含子)，其次為PviTIFY9與PviTIFY3a，由5個外顯子與4個內含子組成，而PviTIFY3b與PviTIFY3c則由4個外顯子與3個內含子構成，PviTIFY8b與PviTIFY5的外顯子與內含子數目相對較少，且PviTIFY5a無3，UTR。以上成員劃歸JAZⅢ組。

PviTIFY8a僅含有TIFY motif，為TIFY亞家族成員，基因結構由3個外顯子與3個內含子組成，歸于TIFY組。

PviTIFY1與PviTIFY2含有其他亞家族成員沒有的GATA Zn-finger結構域，為ZML亞家族成員。在PviTIFY1成員中，PviTIFY1b的內含子與外顯子數目最多，由9個外顯子與8個內含子構成，且其長度在48個PviTIFY中最長，其他成員則由8個外顯子與7個內含子組成，PviTIFY2均含有7個外顯子與6個內含子，且PviTIFY2b無5’UTR。以上成員歸為ZML組

TIFY各成員在柳枝稷內的分組結果同其在物種間的劃分結果(圖1)一致，且每組內進化關系較近的成員間具有近乎相同的內含子/外顯子組成及蛋白保守基序分布。

圖2 PviTIFY在染色體的分布

圖3 PviTIFY的進化樹、基因結構及保守基序

2.5 PviTIFY啟動子區順式作用元件分析

柳枝稷TIFY基因啟動子區順式作用元件統計結果如表3所示，除PviTIFY11m與PviTIFY11s外，其他46個柳枝稷TIFY成員的啟動子區都存在4～10種調控元件，其中大部分成員(60%以上)含有光響應、厭氧與缺氧脅迫及JA，ABA信號調控元件，半數成員包含干旱脅迫及GA，IAA信號調控元件，少部分成員含有低溫脅迫及SA信號調控元件，另有極少部分成員包含生物鐘、細胞周期及創傷應激調控元件。綜上所述，柳枝稷TIFY基因啟動區存在多種脅迫響應元件及激素信號調控元件，可能在柳枝稷抗逆反應及激素信號網絡中發揮作用。

表3 PviTIFY啟動子區順式作用元件分析

2.6 PviTIFY時空表達模式分析

柳枝稷TIFY成員在各種組織及發育階段的表達特性如圖4所示，PviTIFY中表達量較高的是10b，10g，10h，10a，10e，10f與11j，11k，11c，11b，11h及6b，6d，這些成員均為JAZ亞家族成員(圖3)。PviTIFY10的6個成員在剛出現的花序、授粉后25 d的小花與V3期的根中表達量最高，尤其是PviTIFY10b，它在各種組織與發育階段的表達量均是最高的；PviTIFY11的5個成員在授粉后25 d與30 d的小花中表達量較高，且PviTIFY11b與PviTIFY11h在V1與V3期的根、整個地上部、E4期的維管束及剛出現的花序中也有較高表達；PviTIFY6的兩個成員中PviTIFY6b在剛出現的花序、E4期的的莖與葉中表達量較高，在根與地上部也有表達。綜上所述，這些表達量較高的PviTIFY10與PviTIFY11可能在花序與根的發育中發揮作用，還可能影響產量的形成，而PviTIFY6則可能在植株形態建成中發揮功能。

圖4 PviTIFY時空表達模式

2.7 PviTIFY10各成員的表達特性

為驗證柳枝稷TIFY成員的激素應答及脅迫響應特性，我們選取了表達量較高的PviTIFY10計8個基因進行定量實驗。

各成員在不同激素處理下的表達特性如圖5所示：PviTIFY10a，PviTIFY10e與PviTIFY10f在JA處理下表達量升高，在其他激素處理下表達量變化不大；PviTIFY10b，PviTIFY10g與PviTIFY10h在JA與IAA處理條件下表達量是升高的，而在其他激素處理條件下呈現不同程度的下調表達；PviTIFY10c在JA處理下表達量升高最明顯，同時也受到其他激素不同程度的誘導作用；PviTIFY10d在JA處理條件下先下調表達后逐漸上調表達，對其他激素處理響應模式規律性較差。對每種激素來說，JA可誘導PviTIFY10各成員的表達，IAA對PviTIFY10各成員均無抑制作用；SA，Eth，GA，ABA均可誘導PviTIFY10c，但對PviTIFY10b，PviTIFY10g與PviTIFY10h的表達是抑制的。

各基因的脅迫響應模式如圖6所示，PviTIFY10各成員在三種脅迫下的表達模式相同，即鹽處理下各基因的表達量迅速升高，其中PviTIFY10d在鹽脅迫下表達量升高最明顯；干旱處理下各基因同樣上調表達，且PviTIFY10c表達量最高；在冷脅迫中各基因表達量變化不明顯，除PviTIFY10c外，其他成員呈現較低的敏感性。

圖5 PviTIFY10各成員在不同激素處理下的表達模式

綜上所述，PviTIFY10各成員在JA處理及鹽與干旱脅迫下反應強烈，推測其可能在柳枝稷JA信號通路及鹽與干旱脅迫防御反應中發揮功能。

3 討論與結論

柳枝稷為異源四倍體，相對擬南芥、水稻、二穗短柄草等二倍體物種來說，所包含的TIFY基因家族成員數目較多，本研究共鑒定到48個PviTIFY，包含7個ZML、1個TIFY、40個JAZ，各成員TIFY motif的氨基酸序列除TIFYXG形式外包含多種類型，如TLSFXG，TLLFXG，TIVYXG等形式，與前人的報道一致[2]。TIFY蛋白在擬南芥、水稻、柳枝稷3個物種間分為6個類群：PPD，TIFY，ZML，JAZⅠ，JAZⅡ，JAZⅢ，從進化距離上看，PviTIFY同OsTIFY的親緣關系較近。除PviTIFY5b與PviTIFY11s外，其它46個PviTIFY分布在染色體3以外的染色體上，其中半數成員集中分布在染色體9，并且PviTIFY11各成員在染色體9成簇排列，這些信息可為成員間的進化提供依據。

柳枝稷TIFY蛋白按照進化關系及結構特點可分為5組：JAZⅠ，JAZⅡ，JAZⅢ，TIFY，ZML，每組內進化關系較近的成員間具有近乎相同的內含子/外顯子組成及蛋白保守基序分布，同水稻[10]與二穗短柄草[11]的TIFY基因家族成員結構組成規律相同。另一方面，不同分組的成員間基因及蛋白結構的組成差異為TIFY基因家族的進化提供了重要依據[25]。對于PviTIFY的基因結構，PviTIFY11成員中除與PviTIFY10位于同一進化枝的5個成員，剩余的14個成員都不含內含子，如PviTIFY11a與PviTIFY11b，同它們在水稻與二穗短柄草中的同源基因一樣，可能在進化開始時就沒有內含子，或者在進化中內含子丟失了[10-11]；對于PviTIFY的保守基序，JAZ亞家族中僅PviTIFY10與PviTIFY11的N端含有NT motif，同水稻中的OsTIFY10與OsTIFY11[10,26]一樣。此外，其成員PviTIFY10c與PviTIFY11s缺少了Jas domain。這些具有特殊結構的成員可能在柳枝稷的進化中具有獨特性。柳枝稷中ZML亞家族成員的CCT domain分為了兩部分，其N端與JAZ亞家族成員的Jas/CCT-2 motif相似性很高而無法區分，GATA domain也由兩部分組成，其C端與JAZ亞家族成員N端的NT基序同樣具有一定程度相似性，另外，在柳枝稷PviTIFY6，PviTIFY10，PviTIFY11保守基序中還存在motif5，其功能有待研究。

圖6 PviTIFY10各成員在不同脅迫處理下的表達模式

JAZ亞家族的JAZ蛋白不僅是JA信號的關鍵因子，還是激素網絡的調控樞紐：水稻OsJAZ9與OsSLR1的互作介導了JA與GA的拮抗作用，進而協調植株的脅迫響應與生長發育[27]；棉花(Gossypiumhirsutum) GhJAZ3與GhSLR1的互作實現了JA與GA對表皮細胞分化及伸長的調控[28]；黃絲瓜蘚(Pohlianutans)PnJAZ1介導JA與ABA在鹽脅迫下的信號交談[29]。鑒于PviTIFY啟動子區存在多種脅迫響應與激素應答元件(表3)，本研究選定了表達量較高的JAZ亞家族的PviTIFY10成員進行定量實驗來驗證其在激素與脅迫處理下的表達特性，結果表明PviTIFY10對多種激素及脅迫有強烈反應(圖5,6)，推測其可能在柳枝稷脅迫防御反應與激素信號調控網絡中發揮作用。

柳枝稷JAZ亞家族成員具有明顯的時空表達特性，尤以PviTIFYI0各成員在花序、小花及根中的表達量最為顯著(圖4)。Hakata等[26]發現水稻TIFY基因過表達株系可通過JA信號途徑促進植株生長，表現出小花數目增加，開花天數減少、小花育性降低等農藝性狀，其中OsTIFY10b過表達株系小花育性降低最少，因而產量較高。在本研究中OsTIFY10b的同源基因PviTIFY10b，同樣受到JA的誘導作用(圖5)，且在剛出現的花序及授粉后的小花中呈現較高表達(圖4)，結合基因的表達特性及同源基因在功能上的保守性推測PviTIFY10b很可能參與柳枝稷花序發育過程進而影響產量的形成。不僅如此，PviTIFY10b即Pavir.2NG586800(表2)為柳枝稷花逆轉相關候選基因[30]，本課題組曾對柳枝稷幼穗分化即花序發育這一生物學過程進行了顯微觀察[31]，且在利用柳枝稷幼穗進行人工穗芽誘導時發現了柳枝稷花逆轉現象[32-33]，并經轉錄組測序篩選到與柳枝稷花逆轉有關的候選基因[30]，以上研究可為柳枝稷花序發育分子調控機制解析及分子育種奠定基礎。

本研究利用TIFY結構域(PF06200)從柳枝稷基因組中搜索鑒定了48個TIFY家族成員，并且依據其系統進化關系和前人研究結果對家族成員進行了分類。通過對其染色體定位、基因結構、保守基序組成等生物信息學進行分析，進一步確定了柳枝稷TIFY基因家族的分類和進化關系。同時，通過分析TIFY基因家族的啟動子順式作用元件、時空表達模式以及PviTIFY10成員激素應答和脅迫響應的表達特性，初步證明了TITY家族參與激素調控、脅迫應答和花序發育等生長發育過程，為進一步研究柳枝稷TIFY基因家族成員的功能提供了一定的方向和基礎。