噴施ALA對紫花苜蓿耐熱性的誘導效應

李宛宣，王世敏，趙 雁

(1. 云南農業大學園林園藝學院, 云南 昆明 650201； 2. 昭通學院農學與生命科學學院,云南 昭通 657000)

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)廣泛存在于細菌、真菌和動植物細胞中，是葉綠素、維生素和亞鐵紅素等所有四氫吡咯化合物的合成前體[1-2]。ALA也是一種潛在的植物生長調節劑，能增加植物葉綠素的相對含量，提高植物光合作用，調控植物生長和產量，如月季(Rosahybrida)[3]、彩色馬蹄蓮(Zantedeschiahybrida)[4]、馬鈴薯(Solanumtuberosum)[5]和水稻(Oryzasativa)[6]。給植物噴施ALA溶液有利于提高植物對多種非生物脅迫的抗性[7]，ALA可以提高葉片中的抗氧化酶(過氧化物酶(Peroxidase,POD)；抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)等)活性，提高植株清除活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的能力，降低丙二醛(Malonydialdehyde,MDA)含量和相對電導率，控制膜脂過氧化物的產生和大量電解質的外滲，穩定生物膜的完整性，增強葡萄(Vitisvinifera)的抗鹽性[8]和玉米(Zeamays)的抗冷性[9]。此外，ALA還能通過保護光系統II、提高光合運轉速率，增強小麥(Triticumaestivum)[10]和草地早熟禾(Poapratensis)的抗旱性[11]；能通過上調關鍵基因表達量，增強黃瓜(Cucumissativus)的抗熱性[12]和油菜(Brassicanapus)的抗鹽性[13]。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界范圍內廣泛栽培的豆科牧草，具有地面覆蓋率(10%～100%)大、根系深而發達、固氮能力強的特點，也是改善生態環境的優良草種[14-16]，但高溫是限制其在熱帶和亞熱帶地區應用的非生物脅迫之一[17]。高溫脅迫會誘導紫花苜蓿細胞產生高濃度的ROS，進而破壞細胞膜系統的相對完整性，導致MDA含量和相對電導率上升，因此MDA含量和相對電導率常作為衡量高溫脅迫下植物受害程度的指標[18-19]。此外，高溫脅迫還會降低紫花苜蓿的光合作用和呼吸效率，造成植物葉片萎焉、生長緩慢和病蟲害增多，影響其產量和品質[20-22]。植物為了適應環境，通過應激反應，會誘導抗氧化酶活性來提高植物抗性[23]。過氧化物酶(Peroxidase,POD)是植物清除ROS的抗氧化酶之一，為典型的熱敏感酶和誘導酶，其活性變化間接反映紫花苜蓿耐熱性的強弱[24-25]。目前，ALA緩解紫花苜蓿高溫脅迫傷害的研究未見報道。本研究以云南地方品種‘德欽’紫花苜蓿(M.sativaL. ‘Deqin’)為材料，探究在高溫脅迫下噴施不同濃度ALA對其生長發育和生理生化的影響，以期為提高紫花苜蓿耐熱性和生產力提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為‘德欽’紫花苜蓿，由畢玉芬教授提供。將當年采收的種子播于花盆中(基質為蛭石50%+珍珠巖50%)，放置于光照培養箱內，溫度為23℃/20℃(白/夜)，光周期為16 h/8 h(白/夜)，相對濕度為65%，光強為400 μmol·m-2·s-1，每隔2 d澆霍格蘭營養液200 mL。8周后紫花苜蓿處于營養生長期，留下健康、生長一致的小苗進行藥劑噴施和高溫脅迫。

1.2 高溫脅迫方法

藥劑ALA來源于蘇州納美特生物科技有限公司，由吳紅芝教授提供。將4個不同濃度的[0 mg·L-1(清水對照，CK)，10 mg·L-1，30 mg·L-1，50 mg·L-1]ALA溶液噴施于紫花苜蓿葉面，噴施藥劑的時間參照梁金鳳[26]的方法并稍加修改，噴施1.5 h后置于人工氣候箱中進行空氣高溫脅迫，脅迫48 h后迅速噴施相同濃度的ALA溶液，再次脅迫48 h后測定紫花苜蓿的生理和形態指標。脅迫溫度為35℃/25℃(白/夜)，光周期為16 h/8 h (白/夜)，相對濕度為65%，光強為400 μmol·m-2·s-1，每隔2 d澆霍格蘭營養液200 mL。每個濃度處理5盆，每盆1棵苗，用3盆測定形態指標，用2盆測定生理指標，試驗重復3次。

1.3 指標測定

1.3.1形態指標測定 參照梁金鳳[26]的方法并稍加修改，測定12棵紫花苜蓿在高溫脅迫前，每棵苗的葉片數、分枝數和生物量，并進行掛牌標記。高溫脅迫后，測定每個濃度處理后3棵苗的3個指標，計算平均每棵苗的葉片增長率、分枝增長率和生物量增長率。

葉片增長率=(脅迫后的葉片數-脅迫前的葉片數)/脅迫前的葉片數×100%

分枝增長率=(脅迫后的分枝數-脅迫前的分枝數)/脅迫前的分枝數×100%

生物量增長率=(脅迫后的生物量-脅迫前的生物量)/脅迫前的生物量×100%

1.3.2相對電導率測定 參照葉尚紅[27]的方法稍加改良，稱取0.2 g葉位相同并完全展開的新鮮葉片，避開主脈剪成大小一致的葉塊放入試管中，加入15 mL蒸餾水，在室溫下放置30 min，測定電導率S1。置沸水浴中20 min，冷卻后測定電導率S2，并測定蒸餾水電導率S0，按下列公式計算相對電導率。

相對電導率(%)=(S1-S0)/(S2-S0)×100%

1.3.3葉綠體色素含量測定 葉綠體色素包含總葉綠素(葉綠素a、葉綠素b)和類胡蘿卜素，測定參照葉尚紅[27]的方法并稍加改良。稱取0.1 g葉位相同并完全展開的新鮮葉片，用25 mL 80%的丙酮放黑暗條件下浸泡24 h，用分光光度計測定波長663 nm，646 nm和470 nm的光吸收值，并按下列公式分別計算葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素的含量。

Ca(葉綠素a濃度)=12.21A663-2.81A646;

Cb(葉綠素b濃度)=20.13A646-5.03A663;

Cx(類胡蘿卜素)=(1000A470-3.27Ca-104Cb)/229;

C(葉綠素總濃度)=Ca+Cb;

葉綠體色素含量(mg·g-1)=[C(mg·L-1)×提取液總量(ml)]/[葉樣重量(g)×1 000]

其中A470，A646和A663分別代表待測液在470 nm，646 nm和663 nm波長下的吸光度值。

1.3.4MDA含量測定 參照葉尚紅[27]的方法稍加改良，稱取0.3 g葉位相同并完全展開的新鮮葉片，加入2 mL蒸餾水和少量石英砂研磨至勻漿，轉移到20 mL刻度試管中，再用3 mL蒸餾水分兩次沖洗研缽合并提取液。另取一支刻度試管，加入5 mL蒸餾水作空白對照。在提取液和空白對照中各加入0.5%硫代巴比妥酸溶液5 mL，在沸水浴上反應15 min，取出試管冷卻后記下液體體積。轉入離心管中，3 000 rpm離心10 min，取上清液至1 cm比色皿中，測定在450 nm，532 nm和600 nm波長下的光吸收值，并按下列公式計算MDA含量。

提取液中MDA濃度(μmol·L-1)=(A532-A600) / (0.155×L)-0.56×A450

鮮組織中MDA含量(nmol·g-1)=提取液中MDA濃度×V(mL)/W(g)

其中A450，A532和A600分別代表待測液在450 nm，532 nm和600 nm波長下的吸光度值，V為提取液總體積(mL)，W為樣品重量(g)，L為比色皿厚度(cm)。

1.3.5POD活性測定 參照李合生[28]的方法稍加改良，稱取0.2 g葉位相同并完全展開的新鮮葉片，在冰浴上預冷的研缽中加入2 mL預冷磷酸緩沖液(0.05 mol·L-1，pH5.5)混合研磨成勻漿。4℃ 3 000 rpm離心10 min，上清液轉入25 mL容量瓶中，沉淀用磷酸緩沖液反復提取兩次，并轉入容量瓶，最后定容至—80℃低溫保存。POD酶反應體系為：2.9 mL 0.05 mol·L-1磷酸緩沖液、1 mL 2% H2O2、1 mL 0.05 mol·L-1的愈創木酚和0.1 mL酶液。用煮沸10 min酶液作對照，反應體系加入酶液后，立即在35℃的水浴中保溫3 min，然后用分光光度計測定波長470 nm的光吸收值A470，每隔1 min記錄1次吸光度，共記錄9次，然后以每分鐘內A470變化0.01為1個酶活性單位[μ·(g·min)-1]，并按下列公式計算POD活性。

POD活性=△A470×VT/(W×VS×0.01×t)

其中：△A470為反應時間內吸光度的變化值，W為樣品鮮重(g)，t為反應時間(min)，VT為提取酶液總體積(mL)，VS為測定時取用酶液體積(mL)。

1.4 數據處理

用Excel和SPSS 17.0軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 ALA對紫花苜蓿MDA含量的影響

由圖1可知，對照(CK)與噴施不同濃度的ALA溶液相比，紫花苜蓿的MDA含量最高，差異不顯著。隨著ALA濃度的增加，MDA含量持續降低，但差異不顯著。在ALA濃度為50 mg·L-1時，紫花苜蓿MDA含量最低。

圖1 不同濃度ALA對紫花苜蓿MAD含量的影響

2.2 ALA對紫花苜蓿相對電導率的影響

由圖2可知，CK與噴施不同濃度的ALA溶液相比，紫花苜蓿的相對電導率最高，差異顯著(P<0.05)。隨著ALA濃度的增加，相對電導率先降低后升高，但差異不顯著。在ALA濃度為30 mg·L-1時，紫花苜蓿的相對電導率最低。

2.3 ALA對紫花苜蓿POD活性的影響

由圖3可知，CK與噴施不同濃度的ALA溶液相比，紫花苜蓿的POD活性最低。隨著ALA濃度的增加，POD活性持續降低，但差異不顯著。在ALA濃度為10 mg·L-1時，紫花苜蓿的POD活性最高，與對照相比，差異顯著(P<0.05)。

圖2 不同濃度ALA對紫花苜蓿相對電導率的影響

圖3 不同濃度ALA對紫花苜蓿POD活性的影響

2.4 ALA對紫花苜蓿形態特征的影響

由表1可知，噴施不同濃度的ALA溶液能影響高溫脅迫后的紫花苜蓿分枝數、葉片數和生物量。在ALA濃度為0 mg·L-1(CK)時，分枝數、葉片數和生物量的增長率都呈負增長。噴施ALA溶液的處理與CK相比，分枝數和葉片數的增長率不顯著，但噴施藥劑的增長效果比不噴施的效果好。在ALA濃度為10 mg·L-1時，葉片數增長率最高達12%，分枝數和生物量的增長率呈負增長；與CK相比，3個指標差異不顯著，分枝數增長率有所增加，生物量增長率有所降低。在ALA濃度為30 mg·L-1時，生物量增長率最高達16%，差異顯著(P<0.05)，且葉片數增長率呈正增長，分枝數增長率與CK相比有所增加。在ALA濃度為50 mg·L-1時，分枝數增長率最高達31%，葉片數和生物量呈負增長。

2.5 ALA對紫花苜蓿葉綠體色素含量的影響

由圖4可知，噴施不同濃度的ALA溶液能影響高溫脅迫后紫花苜蓿葉綠體色素的含量。隨著ALA濃度的增加，葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素的含量先增高后降低。在ALA濃度為30 mg·L-1時，葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素的含量最高，與CK相比，差異不顯著。在ALA濃度為10 mg·L-1時，葉綠素a、總葉綠素和類胡蘿卜素的含量最低，與ALA濃度為30 mg·L-1時相比，差異顯著(P<0.05)。

表1 不同濃度ALA對紫花苜蓿形態指標的影響

注:不同小寫字母表示縱向差異顯著(P<0.05)

Note:Different lowercase letters indicate significant longitudinal difference at the 0.05 level

2.6 高溫條件下紫花苜蓿各形態指標和生理指標的相關分析

由表2可知，高溫脅迫下紫花苜蓿的分枝數增長率、葉片數增長率、生物量增長率、相對電導率、類胡蘿卜素含量、MDA含量和POD活性兩兩指標之間的相關性不顯著。葉綠素a與葉綠素b (r=1.00，P<0.01)、總葉綠素(r= 1.00，P<0.01)和類胡蘿卜素(r= 0.96，P<0.05)含量呈正相關，與MDA含量、POD活性相關性不顯著。葉綠素b與總葉綠素(r= 1.00，P<0.01)、類胡蘿卜素(r=1.00，P<0.05)含量呈正相關，與MDA含量、POD活性相關性不顯著。總葉綠素與類胡蘿卜素(r= 1.00，P<0.05)含量呈正相關，與MDA含量、POD活性相關性不顯著。

相關系數Thecorrelationcoefficient分枝數增長率Growthrateofbranchnumber葉片數增長率Bladegrowthrate生物量增長率Biomassgrowthrate相對電導率Relativeconductivity葉綠素a含量Chlorophyllacontents葉綠素b含量Chlorophyllbcontents總葉綠素含量Totalchlorophyllcontents類胡蘿卜素含量CarotenoidcontentsMDA含量MDAcontentsPOD活性PODactivity分枝數增長率Growthrateofbranchnumber1.00葉片數增長率Bladegrowthrate0.271.00生物量增長率Biomassgrowthrate-0.690.511.00相對電導率Relativeconductivity-0.03-0.77-0.521.00葉綠素a含量Chlorophyllacontents-0.870.020.820.071.00葉綠素b含量Chlorophyllbcontents-0.89-0.040.790.101.00**1.00總葉綠素含量Totalchlorophyllcontents-0.870.010.810.071.00**1.00**1.00類胡蘿卜素含量Carotenoidcontents-0.79-0.120.650.320.96*1.00*1.00*1.00MDA含量MDAcontents0.25-0.11-0.250.720.130.120.130.361.00POD活性PODactivity0.680.71-0.10-0.75-0.65-0.69-0.65-0.78-0.391.00

注：*表示相關性顯著(P<0.05)，**表示相關性極顯著(P<0.01)

Note:* indicates significant correlation at the 0.05 level,and ** indicates extremely significant correlation at the 0.01 level

3 討論

3.1 噴施ALA提高紫花苜蓿的抗熱性

當植物受到高溫脅迫時，大量的ROS會加深細胞膜脂過氧化損傷和破壞細胞膜的相對完整性，進一步引起各項代謝活動內環境遭受破壞[25]。MDA是細胞膜脂過氧化的最終產物，其含量的高低間接反應植物受傷害的程度[29]。此外，細胞膜的相對完整性被破壞，大量電解質外滲，進而導致膜功能紊亂和植株傷害[30]。MDA含量和相對電導率常用于衡量植物遭受高溫傷害程度的指標[31]，如肇東苜蓿(M.sativaL. cv. Zhaodong)[29]、不結球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)[32]、菜豆(Phaseolusvulgaris)[33]、大豆(Glycinemax)[34]等。在抗逆性研究中，ALA在提高植物的抗逆性方向中具有廣闊的應用前景[35]。ALA是具有多種生物活性的非蛋白氨基酸，可作為植物的一種外源生長調節劑，對緩解植物抗熱脅迫具有重要作用[36-37]。在本試驗中，噴施不同濃度的ALA溶液與CK相比，MDA含量和相對電導率都低，說明高溫破壞了紫花苜蓿細胞膜系統，噴施ALA有利于降低細胞膜脂過氧化程度和細胞膜通透性，提高細胞膜的相對穩定性。隨著ALA濃度的增加，MDA含量逐漸降低，相對電導率先降低后升高，這可能與高濃度的ALA溶液能增加紫花苜蓿細胞電解質的流動性有關。

3.2 ALA調控紫花苜蓿在高溫脅迫下的生長

4 結論

本試驗以‘德欽’紫花苜蓿為材料，觀察高溫脅迫下噴施不同濃度的ALA對紫花苜蓿形態和生理指標的影響。在葉面噴施30 mg·L-1濃度的ALA溶液時，有利于提高紫花苜蓿葉片中POD活性、降低細胞膜過氧化程度和細胞膜通透性，進而保護細胞葉綠體色素和增加其干物質的積累，促進植株的生長發育。