巨菌草內生細菌多樣性及其促生特性

鄧振山，李買平，郝 雷，陳凱凱，李 靜，劉玉珍，張寶寶，齊向英

(1. 延安大學生命科學學院，陜西 延安 716000； 2. 延安市寶塔區畜牧獸醫服務中心，陜西 延安 716000)

巨菌草(Pennisetumsp.)系禾本科(Poaceae)狼尾草屬(Pennisetum)多年生直立叢生型植物[1]，適宜在熱帶、亞熱帶、溫帶生長，可以作為栽培食用菌和藥用菌培養基質的草本植物。巨菌草為典型的C4植物，其生物量高，約為40 t· ha-1·y-1，粗蛋白含量約為15%～22%，是高產優質牧草，具有生長快，粗蛋白和糖分含量高，抗逆性強，管理粗放和適種于各種類型的土壤等特點[2]。

植物內生細菌是一類存在于植物組織內，但不引起宿主植物病害癥狀的微生物[4]。內生細菌廣泛存在于多種健康植物中，通過與植物相互作用，可對宿主植物的生長及抗逆能力起到積極作用[5]。目前為止，巨菌草已經用于平茹(Pleurotusostreatus)和黑木耳(Auricularia?auricula)等多種食藥用菌的栽培[6]，但對巨菌草的研究大多集中在抗寒、抗堿、抗鹽、抗旱等方面[1-3]。

自從在延安市實施“退耕還林還草工程”以來，采取封山育林措施，導致飼草短缺成為制約當地畜牧業發展的瓶頸。因此，為解決延安市畜牧業發展中飼草短缺、成本高及“治溝造地工程”土壤改良問題，2012年延安大學科研人員從國家菌草工程研究中心成功引種巨菌草至延安市，經過幾年的試驗，已成功推廣3萬余畝，促進了當地畜牧業的發展。但目前巨菌草相關的基礎理論研究仍處于起步階段，尤其是關于巨菌草內生菌的研究鮮有報道。鑒于此，本文以巨菌草為研究對象，從中篩選出具促生作用的內生細菌，并通過16S rDNA鑒定促生菌株的分類地位，以期為植物內生促生菌的開發和利用提供依據，也為巨菌草微生物菌肥的開發與應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集及處理

2016年9月在陜西省延安市寶塔區萬花鄉(36°63′97″ N，109°32′07″ E)、福建省福州市倉山區倉山鎮(26°08′55″ N，119°28′22″ E)、新疆昌吉市榆樹溝鎮(44°04′21″ N，87°18′19″ E)、內蒙古巴彥淖爾(沙地)烏拉特后旗巴音寶力格鎮(40°13′55″ N，107°05′05″ E)、內蒙古巴彥淖爾(鹽堿地)臨河區小召鎮(40°30′19″ N，107°02′98″ E)5個生境采集完整巨菌草植株體，從上述樣地采集的樣品依次分別編號為SX，FJ，XJ，NS，NY，采集的巨菌草植株生長性狀良好、無病害癥狀，采集后用無菌袋包裝帶回實驗室，置于4 ℃下保存備用，2 d內處理完。各樣本采樣地的具體信息如表1所示。

表1 各樣本采集點地理位置和氣候信息

1.2 供試培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar,PDA)培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。用于培養酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。用于培養細菌。

察氏培養基：NaNO32 g，K2HPO4·3H2O 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。用于分離和培養真菌。

營養瓊脂(Nutrient Agar,NA)培養基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。用于培養細菌。

高氏I號培養基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。用來培養和觀察放線菌形態特征。

無機磷基本培養基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.1 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，MgCl2·6H2O 5 g，Ca3(PO4)25 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。用于溶磷能力的定性及定量測定。

阿須貝氏(Ashby)無氮培養基：甘露醇10 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.2 g，KH2PO40.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO35 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。用于固氮菌的培養。

1.3 巨菌草內生細菌的分離、純化

采用組織塊分離法和劃線分離法對菌草植株體中的內生菌進行篩選，在超凈工作臺中對材料表面進行消毒。選擇新鮮、健康菌草根、莖、葉，首先去掉表面的泥土等附著物，然后用自來水沖洗干凈，再用無菌水沖洗1次；于95%酒精中浸泡3～5 min后無菌水沖洗3～4次，然后轉入含有效氯為5%的次氯酸鈉溶液中浸泡3～8 min，無菌水沖洗4～5次，最后用70%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗4～5次，晾干備用；在無菌狀態下將材料切成0.2 cm×0.2 cm的小塊，每平板接2～4個植物組織塊，于28℃恒溫靜置培養3～5 d。待培養基中有可見菌落時，挑取周圍菌落移入相應培養基純化，并進行菌落形態描述和編號，置于4℃冰箱中備用。將最后1次沖洗的無菌水涂布于培養基上作為對照，置于恒溫培養箱中靜置培養，檢驗消毒的效果[7-8]。采用多種培養基對巨菌草植株體進行內生細菌分離，挑取分離平板上的單菌落進行多次劃線純化，直至分離出單菌落，記錄單菌落的形態特征、編號、斜面保存。

1.4 菌株促生特性分析

產IAA能力測定 將待測菌株接種于加入色氨酸(1 g·L-1)的NA液體培養基，28 ℃ 180 r·min-1搖床震蕩培養3 d，于4 ℃下12 000 rpm離心后取100 μL上清液加入96孔板中，加入100 μL Salkowski，s試劑混勻，室溫下避光顯色30 min，然后進行觀察。能夠產生IAA的菌株菌懸液上清與Salkowski，s試劑混合會呈現紅色或者粉紅色，而色氨酸是黃色或者無顏色反應[9]，并根據標準曲線計算菌液中的IAA濃度[10-11]。

溶磷能力測定 將篩選得到的不同生境巨菌草內生細菌接種于牛肉膏蛋白胨培養基上進行活化，培養36 h后，將內生細菌分別點接于NBRIP平板中，28℃恒溫暗培養7～10 d，檢查內生細菌的菌落周圍有沒有透明溶磷圈。如果出現透明溶磷圈，則說明該菌株具有溶磷能力，溶磷圈的大小表示菌株溶磷能力大小[12]。并根據標準曲線計算菌液中的磷濃度[13-14]。

潛在固氮能力檢測 將待測菌株接種到NA液體培養基，28 ℃下180 r·min-1搖床震蕩培養36 h后，以10%的接種量把活化好的菌懸液(2.0×109個·mL-1)接種到Ashby液體培養基中，對照接種無菌水，28 ℃靜置培養，7 d后對比處理組與對照組的渾濁情況，明顯渾濁為陽性，即為有固氮活性[15-16]。

產鐵載體能力的測定 將上述分離到的內生細菌接種到CAS檢測培養基，28 ℃下160 r·min-1恒溫培養2～3 d，觀察檢測培養基的顏色變化并記錄。如果檢測培養基的顏色由藍色變為粉紅色，則就說明該菌株具有產鐵載體的能力[17-19]。

抑制病原真菌活性試驗 采用平板對峙法測定上述分離得到的內生細菌的抑菌活性。選取番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.Lycopersic)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum.sp. cucumebriumOwen)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)作為指示菌。從斜面挑取純化的內生細菌菌種和3株供試指示菌分別接種于PDA平板上，待生長旺盛后，用已滅菌的打孔器(r=0.5 cm)在該平板上打孔，將待測的內生細菌接種到PDA固體培養基的四周，在中間接種指示菌，以只中間接種指示菌為對照，置于28 ℃恒溫培養箱中培養2～3 d后，觀察各菌株對指示菌的抑制作用，待抑菌圈不再變化時，用刻度尺測量抑菌圈大小并記錄[20]。

1.5 內生細菌的鑒定

1.5.116S rDNA基因序列的PCR擴增 采用菌落PCR方法[21]擴增促生菌株的16S rDNA，采用細菌通用引物，序列如下：P1(5’-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGC-T-3’)和P6(5’-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’)，若這對引物無法擴增，則用引物：8F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)。所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴增反應體系為：2×Es Taq Masterase (25 μL)、引物(10 μmol·L-1)各1 μL、模板DNA 1 μL，最后補充去離子水至50 μL；反應條件為：94 ℃，5 min；94 ℃變性，30 s；55 ℃退火，30 s；72 ℃延伸，30 s，30 個循環；終延伸：72 ℃，5 min[4]。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，目標條帶約1 500 bp。

1.5.216S rDNA基因序列測定、序列比對及系統發育學分析 將16S rDNA基因擴增產物送至上海生工生物工程有限公司進行測序，測序引物與PCR擴增所用引物相同。將獲得的16S rDNA基因序列提交到美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)的GenBank基因庫，進行BLAST比對，與數據庫中的已知序列進行同源性分析，運用MEGA 6.06 軟件，選用鄰接法(Neighbour-joining)構建系統發育樹[22]，分析菌株的系統發育學特征，獲得GenBank登錄號。

2 結果與分析

2.1 巨菌草內生細菌的分離結果

從5個樣地的巨菌草樣品中共分離得到187株內生細菌：其中陜西51株，占總分離菌株數的27.27%；福建43株，占總分離菌株數的22.99%；新疆34株，占總分離菌株數的18.18%；內蒙古(沙地)28株，占總分離菌株數的14.97%；內蒙古(鹽堿地)32株，占總分離菌株數的17.11%。

2.2 菌株促生特性結果分析

2.2.1IAA產生能力測定結果 本試驗測定結果表明分離自巨菌草植株的187株內生細菌中86株具有分泌IAA的能力，占全部菌株的46%。定量測定結果表明，各菌株產IAA的量不同，其中菌株XJ-4產IAA的能力最強，分泌的IAA濃度為30.13 mg·L-1。分別測定促生能力后，從中篩選出促生效果好的22株代表菌株，其具體的促生特性如表2所示。

表2 巨菌草內生細菌的促生功能特性

續表2

注：表中數據為均數±標準偏差。抑菌圈直徑:“+”表示d≤10 mm;“++”表示10 mm 30 mm;“-”表示無抗性

Note:Values in the table indicated mean±SE. Antibiotic circle diameter:“+” means d≦10 mm;“++” means 10 mm 30 mm;“-” means none inhibitory activity

2.2.2溶磷能力測定結果 經過溶解磷酸鈣能力的定性檢測，共有47株巨菌草內生細菌具有溶磷能力，占全部菌株的25%。定量測定結果表明，各菌株溶磷量不同，其中菌株FJ-23,FJ-15溶磷量最高，分別為7.10 mg·L-1,7.35 mg·L-1(表2)。

2.2.3潛在固氮能力測定結果 本研究中187株巨菌草內生細菌在Ashby無氮培養基中的生長情況顯示，共有128株，64%的巨菌草內生細菌可以正常生長。22株內生細菌中有17株能在培養基液面或者液面以下出現菌膜，顯示這些巨菌草內生細菌具有潛在的固氮能力(表2)。

2.2.4產鐵載體能力測定結果 觀察各內生菌株在CAS檢測培養基中的顯色反應，試驗結果表明有34株內生細菌在檢測培養基中的顯色液反應為粉紅色，說明這些內生細菌具有產鐵載體的能力(見圖1)。

圖1 部分菌株進行產鐵載體定性測定的結果

2.2.5抑制病原真菌活性試驗 結果表明，大部分內生細菌對1種或者多種指示菌具有抑制作用，但是也有一部分內生細菌對3種指示菌都沒有抑制作用，其中菌株SX-21，SX-30，SX-1，NY-10顯示了出對3種指示菌都具有抑菌活性(見圖2和表1)。

圖2 部分代表菌株抑制病原菌能力測定結果

2.3 內生細菌的系統發育學分析

通過對菌株進行系統發育學分析，各菌株的16S rDNA基因序列已提交GenBank數據庫，其序列號如表3所示。經BLAST分析，各菌株與系統發育關系最近種屬的菌株16S rDNA基因相似性如表3所示。

表3 巨菌草內生代表菌株和參比菌株的16S rDNA基因序列相似性比較

對內生細菌和相關模式菌株的16S rDNA基因序列進行比對，并采用MEGA 6.06的Neighbor-joining方法構建系統發育樹，結果顯示：這23株具促生特性的巨菌草內生細菌16S rDNA基因序列與GenBank數據庫中已報道的相關菌株16S rDNA基因序列的相似性均達到99.01%以上。系統發育樹(圖3)顯示，23株菌株分別歸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)的系統發育分支上，說明巨菌草中具促生特性的內生細菌存在豐富的種屬多樣性。

分支I為芽孢桿菌屬，共有16株菌，菌株SX-21，SX-24，SX-30，FJ-6和FJ-7的最相似菌株均為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)，同源性分別為99.59%，99.86%，99.32%，99.32%和100%，其中菌株FJ-7的同源性達100%，說明FJ-7與蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)為同一種菌種，菌株FJ-23，XJ-19，NS-5，NY-16，NY-20的最相似菌株均為巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)，同源性分別為99.66%，99.73%，99.66%，99.66%和99.52%，菌株NY-10，XJ-14，SX-1的最相似菌株均為維氏芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)，同源性分別為99.79%，99.57%和99.79%，菌株SX-2，FJ-19的最相似菌株均為維德曼芽孢桿菌(Bacilluswiedmannii)，同源性分別為99.32%,99.18%。

圖3 菌株16S rDNA基因系統發育樹

分支Ⅱ為根瘤菌屬，由菌株NY-7和其它參比菌株組成。菌株NY-7的最相似菌株為放射根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)，同源性為99.64%。

分支Ⅲ為寡養單胞菌屬，有2株菌。菌株NS-8、XJ-12的最相似菌株分別為Stenotrophomonastumulicola和Stenotrophomonaspavanii，同源性分別為99.59%，99.01%。

分支IV為假單胞菌屬，由菌株NS-18和其它參比菌株組成。菌株NS-18的最相似菌株為湖南假單胞菌(Pseudomonashunanensis)，同源性為99.36%。

分支V為不動桿菌屬，由菌株XJ-16和其它參比菌株組成。菌株XJ-16的最相似菌株為魯氏不動桿菌(Acinetobacterlwoffii)，同源性為99.45%。

分支VI為腸桿菌屬，有2株菌。菌株XJ-4,SX-12的最相似菌株分別為生癌腸桿菌(Enterobactercancerogenus)、非脫羧勒克菌(Leclerciaadecarboxylata)，同源性分別為99.79%，99.65%。

3 討論

本文以不同生境的巨菌草植株體為材料，經篩選共得到187株巨菌草內生細菌，內生細菌會對植物體產生不同的有益效應，包括促進生長、抑制病原菌、溶磷、固氮和提高抗逆能力等[9-11]。本文通過產IAA能力、溶磷能力、固氮能力、產鐵載體能力以及抑制病原菌活性測定，得出分離自巨菌草植株體的187株內生細菌中有86株具有分泌IAA的能力，占全部菌株的46%；有47株具有溶磷能力，占全部菌株的25%；共有128株，占全部菌株64%的巨菌草內生細菌都具有潛在的固氮能力。植物內生固氮細菌通過固氮作用，較根外環境更有利于形成高效固氮體系，進而促進作物的生長及產量的提高，促進宿主對環境的適應，在農業中具有重要的應用潛力。所以，固氮資源的發掘和利用在農業生產應用上具有非常重要的意義，目前已成為國內外研究的熱點[23]。林標聲等[24]采用Ashby和Nfb無氮培養基，從巨菌草成熟期根部分離得到 1株具有高效固氮性能的內生固氮菌(Klebsiellavariicola)。本試驗研究結果與其一致，經篩選，得到1株內生固氮細菌放射根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)。本文對部分促生菌株的16S rDNA基因進行了測序比對，23株菌株分別歸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、產氣腸桿菌屬(Enterobacter)的系統發育分支上，說明巨菌草中具促生特性的內生細菌存在豐富的種屬多樣性。賈雨雷等[25]首次采用高通量測序技術對 6個不同地區巨菌草內生固氮菌群落及其多樣性進行研究，共獲得 64 122 條有效序列，經分析歸屬于 6個門，10 個綱，17 個目，24 個科,33 個屬和 39 個種，以變形菌門和藍藻菌門為優勢內生固氮類群，這 6個地區巨菌草中所共有的且相對豐度最高的內生固氮菌群為變形菌門(Proteobacteria)，其相對豐度為87.56%～99.34%，其中的慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、腸桿菌屬(Enterobacter)和Azohydromonas為共有的優勢內生固氮菌屬，本試驗研究結果與其一致，從巨菌草中篩選出了根瘤菌屬和腸桿菌屬的內生細菌。另外，有34株(占比為18%)的內生細菌具有產鐵載體的能力，促生菌產鐵載體既能增加植物的營養供給，又可以與病原菌競爭鐵素營養從而起到生防作用，是內生菌一種重要的促生和防病機制[26]。

本文研究結果表明巨菌草中具有豐富促生特性的內生細菌種質資源，這對于巨菌草內生固氮菌群資源的開發及其微生物肥料的菌種選育和生產應用具有重要意義。但本文沒有涉及到巨菌草內生真菌的群落多樣性及其組成的研究，下一步通過高通量測序技術將開展對巨菌草內生菌的種類、分布及其變化規律的深入研究。

4 結論

本試驗從巨菌草植株體內分離得到187株巨菌草內生細菌，其中86株具有分泌IAA的能力，47株具有溶磷能力，有128株具有潛在的固氮能力，有34株具有產鐵載體的能力，它們分別占全部菌株的46%，25%，64% 和18%。另外，80%以上的內生細菌對1種或者多種指示菌具有抑制作用。通過對部分促生菌株的16S rDNA基因進行測序比對，發現其分別歸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)的系統發育分支，說明巨菌草中具促生特性的內生細菌存在豐富的種屬多樣性，這為植物內生促生菌的開發和利用提供依據。