ABA浸種對混合蘇打鹽堿脅迫下苜蓿種子萌發受阻的緩解作用

李 波，鄔婷婷，李 紅，楊 曌，林 浩

(1.齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江 齊齊哈爾161005)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一種多年生豆科牧草，世界上廣泛種植，具有產草量高、利用年限長、再生性強、適口性好、營養豐富等特點[1]，對改善土壤理化環境具有一定程度的作用。鹽堿土作為一種土壤類型分布廣泛，全世界的鹽堿土地面積約有9.54×109hm2，分布于各大洲干旱地區，主要集中于歐亞大陸、非洲、美洲西部，我國的鹽堿土地面積為9 913×104hm2，主要分布于東北、華北、西北內陸地區以及長江以北沿海地帶，土地鹽堿化問題已經成為影響世界農業生產的最主要非生物脅迫之一，是影響區域經濟發展和生態恢復的重要因素[2]。不同濃度的鹽溶液對種子的萌發影響不同，同種鹽分對不同牧草的種子萌發的影響也不盡相同。一般低鹽濃度對苜蓿種子萌發均有促進作用，隨鹽處理濃度增高，發芽率一般呈下降趨勢，不同濃度的鹽脅迫下苜蓿種子的適應情況不同，同一苜蓿種子在萌發時對不同鹽的適應情況也不同[3]。外源物質改善植物受到非生物脅迫的手段在現代農業中應用廣泛，脫落酸(Abscisic acid，ABA)作為一種脅迫激素，能夠調節植物對脅迫環境的適應，提升植物對鹽堿脅迫的耐受性，改善鹽堿地上植物的生長[4-5]。本試驗研究通過外施ABA，探討不同濃度ABA溶液浸種對蘇打鹽堿脅迫下苜蓿種子萌發特性的影響，為解決苜蓿種子萌發的鹽害問題提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以2種耐蘇打鹽堿性不同的紫花苜蓿品種的種子作為試驗材料，分別為WL343HQ和龍牧807苜蓿(MedicagosativaL.cv. Longmu No.807)品種種子，均由黑龍江省畜牧研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1混合蘇打鹽堿脅迫苜蓿種子的發芽實驗 挑選籽粒飽滿2種苜蓿品種的種子各100粒，整齊擺放在平鋪充分潤濕的濾紙的發芽盒中，每個品種各處理重復3次。按照NaHCO3∶Na2CO3=9∶1的比例配制蘇打鹽堿溶液(1 mmol·L-1蘇打鹽堿含0.9 mmol·L-1NaHCO3和0.1 mmol·L-1Na2CO3)，倒入平鋪有濾紙的發芽盒中，使濾紙充分潤濕(約20 mL)。蘇打鹽堿脅迫濃度分別為20，25，30，35，40，45，50，55和60 mmol·L-1，對兩種苜蓿種子進行不同濃度蘇打鹽堿脅迫，對照組則使用蒸餾水。擺放完畢后稱重，記錄重量以便每天通過補水維持脅迫溶液的種子的濃度。每天觀察并記錄發芽種子的個數。發芽盒置于HPG-280BX光照培養箱中進行培養，培養溫度為25℃。7 d后隨機選取各處理組10株芽苗測量每個芽苗的胚芽長、胚根長及10株芽苗的總鮮重，測量后的芽苗置于濾紙上陰干5 d，在80 ℃烘干箱烘干至恒重，測量芽苗干重。經7 d后分別選擇兩品種發芽率最接近50%的濃度組進行下一步試驗。

1.2.2ABA處理苜蓿種子 配制不同濃度(25，50，75和100 μmol·L-1)的ABA溶液，對照組為蒸餾水，在避光條件下對2種苜蓿種子進行6 h浸種。浸種結束后，用蒸餾水將浸種的種子洗滌2次，洗滌過后，WL343HQ苜蓿種子使用濃度為40 mmol·L-1的蘇打鹽堿溶液進行脅迫，龍牧807苜蓿種子使用濃度為35 mmol·L-1的蘇打鹽堿溶液進行脅迫，培養條件和測定指標同1.2.1。

1.2.3測定指標 各指標測定公式[1]如下：

發芽率(%)= G7/N×100%；

發芽勢(%)=G3/N×100%；

發芽指數(%)(GI)=ΣG7/D7×100%；

活力指數=GI×S。

其中G3表示3 d內的發芽數，G7表示7 d內的發芽數，Dt表示相應的發芽日數，N為種子總數，S表示平均主根長度(mm)。

胚根長(mm)：每組發芽盒中10株長勢均勻的萌發芽苗胚根的平均值；

胚芽長(mm)：每組發芽盒中10株長勢均勻的萌發芽苗胚芽的平均值；

鮮重(mg)：每組發芽盒中10株長勢均勻的萌發芽苗的總重量；

干重(mg)：每組發芽盒中10株長勢均勻的萌發芽苗烘干后的總重量；其中根長、芽長和鮮重于試驗培養第7 d進行測定。

1.2.4數據處理與分析 數據用SPSS19.0和Excel軟件進行統計分析，采用單因素方差分(ANOVA)和新復極差法(Duncan)比較同一品種的不同處理間的差異顯著性，P<0.05時有統計學意義。數值為平均值±標準差。

數據標準化：

隸屬度的計算[6]：對測得數據進行用模糊數學隸屬度公式進行轉換，隸屬函數公式為：

U(Xijk)=(Xijk-Xmin)/(Xmax-Xmin)

公式中，U(Xijk)、U′(Xijk) 為第i個品種第j個脅迫濃度的k項指標的隸屬度，Xmin、Xmax分別為k項指標的最小值和最大值。

2 結果與分析

2.1 混合蘇打鹽堿脅迫對苜蓿種子發芽率的影響

不同濃度(20～60 mmol·L-1)混合蘇打鹽堿對兩種苜蓿種子脅迫時發芽率變化見表1。在同一蘇打鹽堿脅迫濃度下，種子發芽率為WL343HQ>龍牧807。

兩種苜蓿品種種子發芽率均隨蘇打鹽堿濃度增加呈下降趨勢，種子發芽率均低于對照組。35 mmol·L-1以下低蘇打鹽堿濃度對WL343HQ種子萌發抑制作用較小，高于40 mmol·L-1蘇打鹽堿濃度嚴重影響WL343HQ種子萌發，發芽率均低于60%；而龍牧807種子在蘇打鹽堿脅迫濃度為55和60 mmol·L-1時，種子的發芽率為0，說明此濃度下完全抑制了龍牧807苜蓿種子的萌發。30 mmol·L-1以下低蘇打鹽堿濃度對其種子萌發的抑制作用較小，高于35 mmol·L-1蘇打鹽堿濃度嚴重影響龍牧807種子萌發，除龍牧807在20 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫濃度外，其它蘇打鹽堿濃度下兩品種種子的發芽率均與對照差異顯著(P<0.05)。

為確定兩種苜蓿種子耐蘇打鹽堿適宜濃度，以種子發芽率作為蘇打鹽堿脅迫適宜濃度指標，對兩種苜蓿種子發芽率進行線性回歸，回歸曲線和回歸方程見圖1，WL343HQ對蘇打鹽堿脅迫的半致死濃度為42.41 mmol·L-1，龍牧807的半致死濃度為36.61 mmol·L-1，確定WL343HQ和龍牧807后續試驗蘇打鹽堿濃度分別采用40 mmol·L-1和35 mmol·L-1。

圖1 蘇打鹽堿脅迫下2種苜蓿種子發芽率的變化

表1 蘇打鹽堿脅迫下苜蓿種子的發芽率

注：同列不同小寫字母表示脅迫濃度間在0.05水平差異顯著;“0” 代表在脅迫處理下種子未萌發，下同

Note:Different normal letters in line show significant different among stress concentration at the 0.05 level;“0” indicates no germinate of seedings under stress treatment,the same as below

2.2 ABA對受混合蘇打鹽堿脅迫苜蓿種子萌發的影響

2.2.1發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數 經不同濃度的ABA緩解處理的受蘇打鹽堿脅迫的WL343HQ和龍牧807苜蓿種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數均隨ABA濃度的增加呈先升后降趨勢，各指標均在ABA濃度為75 μmol·L-1時達到最高值(表2，表3)。在相同ABA濃度下，發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數均為WL343HQ>龍牧807。

WL343HQ發芽率在ABA濃度為50～100 μmol·L-1時均高于對照(ABA濃度0 μmol·L-1，鹽堿濃度為40 mmol·L-1)，除25 μmol·L-1ABA濃度外，其它ABA處理組發芽率均與對照差異顯著(P<0.05)；龍牧807發芽率在ABA處理濃度為75和100 μmol·L-1時高于對照(ABA濃度0 μmol·L-1，鹽堿濃度為35 mmol·L-1)，除50和100 μmol·L-1ABA濃度外，其它ABA處理組發芽率均與對照差異顯著(P<0.05)。WL343HQ發芽勢在ABA濃度為25 μmol·L-1時低于對照，50～100 μmol·L-1時均高于對照，除50 μmol·L-1ABA濃度外，其它ABA處理組發芽勢均與對照差異顯著(P<0.05)；龍牧807僅在ABA濃度為75 μmol·L-1時高于對照，除50 和100 μmol·L-1ABA濃度外，其它ABA處理組發芽勢均與對照差異顯著(P<0.05)。

WL343HQ發芽指數在ABA濃度為75和100 μmol·L-1時高于對照，除50 μmol·L-1ABA濃度外，其它ABA處理組發芽勢均與對照差異顯著(P<0.05)；龍牧807發芽指數僅在ABA濃度為75 μmol·L-1時高于對照，除100 μmol·L-1ABA濃度外，其它ABA處理組發芽指數均與對照差異顯著(P<0.05)。WL343HQ和龍牧807苜蓿種子的活力指數在各ABA濃度下均高于對照，兩種苜蓿種子的活力指數除25 μmol·L-1ABA處理濃度外，其它ABA處理組活力指數均與對照差異顯著(P<0.05)。

2.2.2胚芽長、胚根長、鮮重和干重 經不同濃度的ABA緩解處理的受蘇打鹽堿脅迫的WL343HQ和龍牧807芽苗的胚芽長、胚根長、鮮重和干重均隨ABA濃度的增加呈先升后降趨勢，均在75 μmol·L-1時達到最大值(表2，表3)。在相同ABA濃度下，胚芽長和胚根長均為WL343HQ<龍牧807(100 μmol·L-1ABA除外)，鮮重和干重均為WL343HQ>龍牧807。

WL343HQ和龍牧807胚芽長在各濃度ABA處理均高于對照，兩種苜蓿芽苗的胚芽長在各濃度ABA處理組均與對照差異顯著(P<0.05)，WL343HQ和龍牧807兩種苜蓿芽苗的胚根長在各濃度ABA處理組均高于對照，兩種苜蓿芽苗的胚根長在各濃度ABA處理組均與對照差異顯著(P<0.05)。

WL343HQ和龍牧807兩種苜蓿芽苗的鮮重在各濃度ABA處理下均高于對照，除25μmol·L-1ABA濃度的WL343HQ芽苗的鮮重外，兩種苜蓿在各濃度ABA處理組均與對照差異顯著(P<0.05)。WL343HQ苜蓿芽苗的干重在各濃度ABA處理下均高于對照，龍牧807芽苗的干重在ABA濃度50～100 μmol·L-1時高于對照，除25 μmol·L-1ABA濃度外，兩種苜蓿芽苗的干重在各ABA處理組均與對照差異顯著(P<0.05)。

表2 WL343HQ萌發指標

表3 龍牧807萌發指標

2.3 ABA對苜蓿種子萌發緩解效果綜合分析

兩種苜蓿種子在ABA緩解處理下種子萌發的發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數、胚芽長、胚根長、鮮重和干重8項形態指標變化不同，應用單一指標不能準確反映ABA緩解作用。對不同ABA濃度處理下的兩種苜蓿種子萌發的發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數、胚芽長、胚根長、鮮重和干重的8項指標的變化進行隸屬函數值計算，將各項隸屬函數法累加進行綜合分析(見表4)。WL343HQ和龍牧807苜蓿種子萌發在不同ABA濃度處理下的隸屬值的排序均為：75 μmol·L-1>100 μmol·L-1>50 μmol·L-1>25 μmol·L-1>0 μmol·L-1，不同ABA濃度對蘇打鹽堿脅迫下的苜蓿種子萌發均產生一定的緩解作用，特別是ABA濃度為75 μmol·L-1時可對蘇打鹽堿脅迫下的苜蓿種子萌發有較好的緩解作用。

表4 ABA緩解蘇打鹽堿對2種苜蓿種子萌發及芽苗生長的隸屬函數值

注：GR，GP，GI，VI，EL，RL，FW和DW分別代表發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數、胚芽長、胚根長、鮮重、干重

Note：GR,GP,GI,VI,EL,RL,FW and DW represent germination rate，germination potential,germination index,vitality index,embryo length,radical length,fresh weight,and dry weight

3 討論

鹽堿脅迫是影響生物生長的重要逆境因素之一，主要通過滲透作用與離子毒害作用對種子萌發產生抑制作用，而堿脅迫對種子萌發的抑制在鹽脅迫的基礎上，還包括較高的pH值作用，會使種子發生離子失衡，因此對植物種子的傷害作用更強[7-8]。Na2CO3和NaHCO3等堿性鹽所造成的堿脅迫對植物的破壞作用明顯大于由NaCl和Na2SO4等中性鹽所造成的鹽脅迫。Na2CO3和NaHCO3是內陸蘇打鹽堿土的主成分，生長在此類土壤上的植物受到Na+、低水勢和高pH的多重脅迫[9-11]。本試驗的研究結果發現，隨著蘇打鹽堿濃度的增加，2種苜蓿種子發芽率降低，但在蘇打鹽堿濃度為20～35 mmol·L-1(WL343HQ)和20～30 mmol·L-1(龍牧807)時的每個處理濃度下的苜蓿種子的發芽狀況均表現良好，體現了2種苜蓿種子具有一定的抗蘇打鹽堿能力，蘇打鹽堿濃度超過60 mmol·L-1時，2種苜蓿種子的很難萌發。這與藺吉祥[12]等人研究鹽堿脅迫對紫花苜蓿種子發芽的協同影響的結果一致。

ABA在植物體內是一種重要的生長調節激素，在植物受到脅迫時，ABA可緩解應激脅迫對植物帶來的損害[13]。目前，在ABA緩解高溫、低溫、干旱、鹽脅迫等方面均有研究。本研究利用不同濃度的ABA對苜蓿種子的發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數及芽苗的胚芽長、胚根長、鮮重、干重指標進行測定，結果表明供試的外源激素濃度在75～100 μmol·L-1范圍內對2種苜蓿種子的萌發和芽苗早期生長均有顯著促進作用。通過試驗研究發現，ABA可以有效緩解蘇打鹽堿脅迫帶來的負效應，經過適宜濃度(75 μmol·L-1)的ABA處理的苜蓿種子的發芽率、發芽勢、發芽指數及活力指數均較對照提高，也就是說ABA可以使蘇打鹽堿脅迫下的苜蓿種子出芽數增多，整齊度一致，生長活力提高。ABA的這種正效應是維持在一定濃度范圍內的，可能是由于激素的正向調控作用存在一定的范圍。

通常認為，ABA可誘導種子的休眠并抑制胚過早萌發，ABA對某些植物的種子萌發及幼苗生長發育具有一定的促進作用[14]。ABA作為脅迫激素還可提高植物對逆境的抵抗能力。研究中在一定蘇打鹽堿濃度下利用不同濃度ABA浸種處理2種苜蓿，能刺激苜蓿芽苗的胚芽、胚根部伸長和生物量積累，這顯示ABA處理對蘇打鹽堿脅迫下幼苗生長具有一定的緩解作用，特別是在ABA濃度為75 μmol·L-1時對2種苜蓿蘇打鹽堿抑制作用有最大的緩解作用。這和彭浩等[15]研究脫落酸對鹽脅迫下玉米種子萌發和幼苗生長的影響結果相似。該結果對蘇打鹽漬化土壤環境下苜蓿牧場建植有一定的參考作用，應用于生產實踐或者其他牧草是否有明顯的緩解效果有待于進一步驗證。

4 結論

2種苜蓿種子受蘇打鹽堿脅迫作用降低其種子的發芽率，WL343HQ和龍牧807苜蓿種子對蘇打鹽堿脅迫的半致死濃度分別為40 mmol·L-1和35 mmol·L-1；ABA作為脅迫因素對2種苜蓿蘇打鹽堿脅迫的種子萌發和芽苗生長均有促進效應，ABA浸種可有效提高蘇打鹽堿脅迫下苜蓿種子的萌發能力，隨著ABA處理濃度的增加，苜蓿在蘇打鹽堿脅迫下的種子萌發能力逐漸提高，其中以75 μmol·L-1處理效果最好，超過75 μmol·L-1后苜蓿種子的萌發能力和芽苗生長效果降低。ABA濃度為75 μmol·L-1時，可最大程度的緩解蘇打鹽堿對2種苜蓿種子萌發的抑制作用。