內生菌HL-1可濕性粉劑研制及其除草活性評價

朱海霞，馬永強*

(1. 青海大學農林科學院，青海 西寧 810016； 2. 青海大學省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海 西寧 810016； 3. 農業部西寧作物有害生物科學觀測實驗站，青海 西寧 810016；4. 青海省農業有害生物綜合治理重點實驗室，青海 西寧 810016)

雜草控制是農業生態系統中面臨的主要問題之一，是農業生產中的重要環節。雜草危害每年可導致全球農業950億美元損失[1,2]。青海省共有農田雜草25科67種，以藜(ChenopodiumalbumL.)、密花香薷(ElsholtziadensaBenth.)、豬殃殃(GaliumaparineL.)、酸模葉蓼(PolygonumlepathifoliumL.)為代表性的闊葉雜草是構成該地區保護性耕作農田雜草群落的主要優勢種，相對優勢度≥5，對作物生長發育及產量影響嚴重，防除較為困難[3,4]。目前，全世界對于雜草的控制多依賴于化學藥劑的使用，化學藥劑的長期大量使用也帶來了許多農田生態環境問題[5]，例如抗除草劑雜草植株的出現、土壤污染、水質退化、以及對非目標生物的危害等[6,7]。

隨著人類環境意識的增強和農業可持續發展的需要，化學農藥的發展面臨前所未有的巨大壓力，生物除草劑的開發利用越來越受到關注，且已經取得一定成果[8,9]。目前全球公布的商業化的生物除草劑產品已有20多個[10,11]。充分利用豐富的雜草病原微生物資源，開發無污染、無藥害的微生物除草劑，不僅能夠有效控制難除雜草種群，而且對目標雜草以外的植物影響小，環境負效應小，安全性高[12-14]。微生物除草劑有益于生態結構的動態平衡而成為生態農業中防治草害的首選，成為一些化學農藥的替代品[15]。在未來除草劑發展領域中，開發具有特色的生物除草劑研發、商業化應用體系，具有廣闊的應用前景[16,17]。內生菌HL-1分離自化隆阿岱患病大刺兒菜(Cephalanoplossetosum(Willd.) Kitam)葉片，前期發現該菌株對闊葉雜草豬殃殃、藜、密花香薷等表現出較好的除草活性，作物安全性試驗表明，其發酵液對小麥(TriticumaestivumL.)、蠶豆(ViciafabaL.)安全，對油菜(BrassicanapusL.)、豌豆(PisumsativumL.)和青稞(HordeumvulgareL.)有輕微影響，該菌株可作為春小麥和蠶豆田中微生物除草劑候選菌種進行后續研究[18]。

微生物除草劑選擇合適的配方劑型，可以在一定程度上克服其對環境的依賴性，提高生物除草劑的控草效果[19]。將生防菌株制成一定的劑型，能夠提高生物除草劑的穩定性，并延長持效期。為了安全、經濟、有效地利用該菌株，充分發揮活體微生物自身的作用特征，擴大應用范圍，更大發揮防治效果，對該菌株進行劑型研制，可達到安全、高效和使用方便的目的。因此，本研究以菌株HL-1為研究對象，篩選適宜該菌株發酵的碳氮源、固體發酵基質及適宜載體和助劑，初步研制出可濕性粉劑。同時，利用制備的可濕性粉劑在活體盆栽和田間小區環境下，測定對青海地區農田惡性雜草繁縷(StellariamediaL.)、藜、灰藜(ChenopodiumglaucumL.)和密花香薷4種雜草的防除效果，為將該菌開發成為小麥、蠶豆田微生物除草劑提供理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

內生菌HL-1分離自青海省化隆阿岱自然發病的大刺兒菜葉片，由青海省農業有害生物綜合治理重點實驗室分離保存。

1.2 試驗方法

1.2.1最適碳氮源的篩選 選用可溶性淀粉(C1)、麥麩(C2)、蔗糖(C3)、玉米粉(C4)、小麥粉(C5)作為碳源，按培養基量的2%加入馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA)培養基中替換原本培養基中的碳源-葡萄糖(C6)，充分攪拌均勻，制成6種不同的碳源培養基。經121℃高壓蒸汽滅菌后，于超凈工作臺內倒入滅菌后的培養皿中冷卻凝固，選取活化的、生長旺盛的菌餅(直徑Φ=8 mm)接入培養基(Φ=9 cm)中央，置于25℃生化培養箱中培養；3 d，5 d，7 d時分別測量菌落直徑，7 d后在培養基中加入10 mL無菌水，用載玻片輕輕刮下菌絲，以四層無菌紗布濾去菌絲得到孢子懸浮液，用分光光度計在600 nm波長下測定吸光度值(Optical density，OD)，確定最佳碳源。每個處理設3個重復。

以等質量的大豆粉(N1)、酵母浸粉(N2)、蛋白胨(N3)、NaNO3(N4)、(NH4)2SO4(N5)、尿素(N6)作為外加氮源，按培養基量的2%加入PDA培養基中，充分攪拌均勻，配制成不同的外加氮源培養基，以不加入外加氮源的PDA培養基作為對照組(Control check，CK)。將6種培養基經121℃，21 min高壓蒸汽滅菌后，于超凈工作臺內倒皿、冷卻凝固，接菌培養，方法同上。3 d，5 d，7 d測量菌落直徑，7 d后按上述分光光度計法測定量OD值。確定最佳氮源。

1.2.2固態發酵基質的確定 菌株HL-1經活化后接種于液體馬鈴薯葡萄糖(Potato dextrose agar，PD)培養液中，于25℃,180 r·min-1振蕩培養5 d，稀釋成為濃度為1.0×108個·mL-1孢子量的種子液備用。選擇玉米粉、麥稈糠、麥麩、菜籽餅、羊糞、珍珠巖作為6種固態發酵基質，分別加入適量的無菌水和2%已篩選出的碳氮源，經高壓滅菌后，每瓶25 g分裝于250 mL三角瓶中，每瓶接種5 mL種子液后室內恒溫培養。每處理設3個重復。發酵10 d后稱取固體發酵物10 g裝入250 mL三角瓶中，加入無菌水充分振蕩，過濾殘渣獲得孢子懸浮液，使用分光光度計法測定孢子懸浮液的OD值，血球技術板測定不同基質的產孢量，選擇最佳的底物發酵基質。

1.2.3菌株HL-1載體和助劑的篩選 將載體(高嶺土、拉開粉、硅藻土、爐渣、石灰石、黏土、沙子)、穩定劑(膨潤土、白炭黑、輕質碳酸鈣)、分散劑(羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)、聚乙烯醇、木質素磺酸鈉、吐溫)、保護劑(腐殖酸、海藻酸鈉、可溶性淀粉、糊精)、潤濕劑(SDS、拉開粉)共20種載體和助劑，以2%的比例添加到菌株HL-1對應的最適培養基，以不添加任何載體助劑的處理作為對照。菌株HL-1平板打菌餅，取一塊8 mm的菌餅接種于含不同載體或助劑的培養基中央，接種3 d，5 d，7 d時分別測量菌落直徑，7 d后用分光光度計測定孢子懸浮液在600 nm下的吸光度值OD600，評價不同載體助劑對菌株的影響。

1.2.4可濕性粉劑的初步制備 將在PDA斜面上培養7 d后的HL-1菌株制成菌懸液，以體積分數2%的接種量接種于PD培養液，液體培養5 d，獲得種子液備用。以蔗糖為碳源，酵母浸粉為氮源，麥麩為發酵基質，按體積分數為0.3 mL·g-1的接種量接種種子液，25℃培養條件下固體培養10 d。獲得的固體發酵物于干燥箱烘干、初步粉碎，制成菌粉[20]。

將HL-1菌粉與篩選出的適宜載體、助劑混合，按照50%的載體、6%的分散劑、5%的保護劑、3%的潤濕劑和1%穩定劑的比例初步粉碎、混勻，于小型高速粉碎機中進一步粉碎，混勻，進行可濕性粉劑的研制[21]。

1.2.5HL-1可濕性粉劑對盆栽雜草及田間小區雜草的防除作用 將田間生長6～10葉期，葉色正常的藜、密花香薷、灰藜和繁縷植株連根挖起，移栽于上下口直徑分別為15 cm和11 cm，高13 cm的塑料花盆中，每盆6～8株，置于實驗室內培養一周；將HL-1可濕性粉劑按10%的質量分數稀釋溶解，濾去雜質后噴霧接種到移栽的雜草植株上，噴霧至莖葉開始滴液為度，每處理3次重復。以接種自來水的植株作為對照。接種后24 h保濕培養，7 d后調查雜草發病株數，稱鮮重，按以下公式統計發病率、鮮重效。

發病率(%)=發病株數/調查總株數×100

鮮重效(%)=(對照雜草鮮重-處理雜草鮮重)/對照雜草鮮重×100

將HL-1可濕性粉劑按10%的質量分數稀釋溶解，噴霧接種到4～10葉期田間小區雜草藜、密花香薷、灰藜和繁縷植株上，接種方法同上，每處理3次重復。試驗各小區面積為0.6 m×0.3 m，接種7 d，調查雜草發病程度，方法如上，統計該菌株可濕性粉劑對田間小區4種雜草的控制效果。

1.2.6數據的統計和分析方法 所有試驗數據采用DPS 7.5軟件進行統計分析，采用Duncan新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 最適碳氮源的篩選

菌株HL-1接種于不同的碳氮源培養基中，培養3 d，5 d，7 d時分別測量菌落直徑，計算重復3次直徑的平均值。孢子懸浮液培養7 d后測定其在600 nm處的吸光度值OD600。由表1可以看出，不同碳源培養基之間菌落直徑和OD600均存在極顯著差異。其中，菌株HL-1在C3蔗糖上生長直徑最大，生長速度最快，OD600與其它碳源培養基之間存在顯著差異。在C4玉米粉上的生長直徑和OD600均值略低于C3蔗糖。其次是葡萄糖、小麥粉、麥麩。在C1可溶性淀粉上的菌落直徑最小，生長速度最慢。故可確定適宜菌種HL-1生長的最適碳源為蔗糖。

表2數據顯示，不同氮源培養基之間菌落直徑、OD600亦存在顯著差異，N2酵母浸粉明顯高于其他培養基處理。HL-1在N2培養基上生長狀態最好，生長速度最快，菌落在N3蛋白胨培養基上的生長初期狀態與N2基本相同，但后期生長速度慢于N2，與對照組PDA培養基相比，N2，N3，N4培養基上菌落的生長狀態均優于PDA培養基，說明這3種氮源對菌落生長起到促進作用；從OD值來看，N2，N3明顯優于PDA培養基，N4與PDA培養基相當。而N1，N6培養基上菌落直徑明顯小于PDA培養基，說明N1，N6對HL-1菌落的生長和產孢起抑制作用。故可確定HL-1的最適氮源為酵母浸粉。

表1 不同碳源培養基上HL-1的菌落直徑及OD600值

注：同列不同小寫英文字母表示在5%水平上差異顯著(P<0.05)，下同

Note:Different lowercase letters in the same column (after data) indicate significant difference at the 5% level (P<0.05),and the same below

表2 不同氮源培養基上HL-1的菌落直徑及OD600值

2.2 HL-1固態發酵基質的篩選

單因素篩選試驗篩選菌株HL-1的固體發酵基質。以產孢量和吸光度值OD600為指標，由表3可以看出，HL-1在不同的固態基質上產孢量、OD600值由高到低為麥麩>玉米粉>菜籽餅>羊糞>麥稈糠>珍珠巖。除麥麩和玉米粉之間不存在顯著性差異外，其它各基質之間存在顯著性差異。HL-1在麥麩發酵基質上的產孢量及孢子液吸光度OD600值分別為4.00×109個·mL-1和0.69。因此，HL-1的最適固態發酵基質選定為麥麩。

2.3 載體和助劑的篩選

菌株HL-1在含不同載體、助劑的培養基上的菌落直徑及OD600值測量結果如下：

由表4可以看出，菌株HL-1在不同載體及助劑上其菌落直徑及OD600值存在不同程度的差異，添加載體硅藻土后，OD600平均值為0.60，7 d時菌落直徑為85.41 mm，菌落生長速度最快。添加載體膨潤土后，OD600平均值為0.58，7 d時菌落直徑為81.38 mm；添加載體羧甲基纖維素后，OD600平均值為0.52，7 d時菌落直徑為84.33 mm；添加載體可溶性淀粉后，OD600平均值為0.57，7 d時菌落直徑為81.82 mm；SDS完全抑制菌落生長。菌株生長綜合原料成本選擇硅藻土、膨潤土、羧甲基纖維素和可溶性淀粉分別作為HL-1的載體、穩定劑、分散劑、保護劑。

表3 不同固態發酵基質上菌株HL-1的產孢量及孢子液OD600值

表4 不同載體、助劑上菌株HL-1 OD600值及菌落直徑

2.4 菌株HL-1可濕性粉劑制備

以蔗糖為碳源，酵母浸粉為氮源，菌株HL-1在麥麩底物基質的培養基中發酵后，產生大量白色菌絲體。培養至充分產孢，將其混勻，粉碎，得到HL-1菌粉。獲得的菌粉是發酵產生的孢子、菌絲體與固態基質的混合物，顆粒大小均勻，細膩，呈粉狀，不易結塊。

以硅藻土作為載體，可溶性淀粉作為保護劑，羧甲基纖維素作為分散劑，膨潤土作為穩定劑，結合適量的拉開粉作為潤濕劑，進行可濕性粉劑的制備。雖然拉開粉對菌落生長未起到促進作用，但在農藥配制過程當中，它可以保證菌粉的快速潤濕，因此，本試驗中選用拉開粉作為潤濕劑，進行可濕性粉劑的配制。

將篩選出的適宜載體、助劑與HL-1菌粉按照50%的載體、35%的菌粉、6%的分散劑、5%的保護劑、3%的潤濕劑、1%穩定劑比例混合，將樣品磨細、混勻，于粉碎機中粉碎，再混勻，初步制成可濕性粉劑。

2.5 HL-1可濕性粉劑對雜草的防除作用

2.5.1HL-1可濕性粉劑對4種盆栽雜草的防效 HL-1可濕性粉劑接種7 d后，4種雜草表現出不同程度的致病效果(表5)。通過發病率和鮮重效進行綜合分析，發現HL-1可濕性粉劑對繁縷致病效果優于其他3種雜草，發病率與鮮重效分別是85.50%，84.74%。對灰藜、密花香薷的防效次之，發病率與鮮重效分別是68.00%與65.05%，63.20%與61.23%。4種雜草中對藜的致病力最弱，發病率和鮮重效分別是56.80%，55.47%。

表5 菌株HL-1可濕性粉劑對不同雜草盆栽除草效果

注：同列不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。下同

Note:Different lowercase letters in the same column indicate significant differences atP<0.05 level. The same as below

2.5.2HL-1可濕性粉劑對田間小區雜草的防效 將HL-1可濕性粉劑溶解后噴霧接種到田間小區4～10葉期雜草植株上，發現該菌株對密花香薷、灰藜、繁縷、藜表現出較強的除草活性，其中，對繁縷和灰藜致病效果顯著，密花香薷次之，對藜的致病效果最弱(圖1)。該結果與盆栽防效一致。表6結果顯示，噴霧7 d后，HL-1可濕性粉劑對田間小區雜草繁縷的發病率和鮮重效分別是84.50%和85.36%，對灰藜的發病率和鮮重效分別是79.60%，73.53%，對密花香薷是71.00%，67.69%。綜合盆栽及田間小區除草效果，可初步得出該菌株可成為田間防除繁縷、藜和密花香薷等雜草的微生物除草劑。

圖1 HL-1可濕性粉劑對小區雜草的防效

表6 菌株HL-1可濕性粉劑對田間小區雜草的防除效果

3 討論

用生物方法防除雜草的重要意義在于能減少對環境的污染、延緩或阻止雜草抗藥性的產生，保護生物多樣性和提高食品安全，有利于人類健康和環境可持續發展。作為一類重要的生防產品，微生物農藥中碳氮源、固體發酵基質及助劑的篩選和合理使用是確保微生物生長、侵染寄主植物以及達到理想除草效果的關鍵，對增強農藥穩定性、延長農藥保存時間、提高農藥安全性等有著重要的影響。隨著當前發酵技術的日趨優化、劑型加工技術的不斷成熟，固態發酵和劑型加工技術為微生物除草劑的生產提供了技術支持，是微生物除草劑實現產業化生產的關鍵，為生物農藥提供了前所未有的發展契機[22]。

碳、氮源是微生物生長的物質基礎，是微生物固態發酵過程中重要的影響因素之一[23]。本研究篩選出菌株HL-1最適碳源為蔗糖，最適氮源為酵母浸粉。以蔗糖和酵母浸粉分別作為補充碳氮源，可提高發酵水平，滿足菌株生長整個過程中碳、氮源需求，促進菌株的產孢量。生防菌的固態發酵基質的選取一般都是價格低廉、容易獲得的農副產品下腳料[24]，本試驗中，生防內生菌HL-1在固態基質上的生長優劣狀況表現為麥麩>玉米粉>菜籽餅>羊糞>麥稈糠>珍珠巖，由此得出麥麩可作為生防菌株HL-1最適產孢固態基質，可降低生產成本，增加發酵過程中的通氣度，且方便菌劑儲存和運輸。

微生物農藥一般是由有效成分、惰性載體和助劑三部分組成[25]。載體是利用吸附性強的惰性材料作為荷載或稀釋農藥的基質，助劑是微生物農藥劑型設計中提高活性的重要成分，可以保護和幫助微生物適應不同的外界環境、有利于其侵染寄主、提高農藥的擴散和吸收、調控農藥的釋放速度[26-27]。在生防菌劑中添加適宜的載體和助劑是保證菌劑能夠在較長時間內保持防治效果的一種有效措施[28-29]。合適的劑型可以改善生物除草劑對環境條件的依賴性，增加對雜草的附著力、親和力、穩定性和生物活性。綜合考慮生產成本、環境和藥效方面，本文對菌株HL-1的固態發酵、配方、劑型進行了初步研究，在確定了碳氮源、最適固態發酵基質的基礎上，篩選出適宜載體為硅藻土，保護劑為可溶性淀粉，分散劑為羧甲基纖維素，穩定劑為膨潤土，潤濕劑為拉開粉。將各種載體和助劑，按一定配方比例，制備出了可濕性粉劑。潤濕劑、分散劑等助劑的加入，使該菌加到水中后能被濕潤、分散、形成懸浮液，可噴灑施用。同時，可濕性粉劑生產成本低，便于包裝，且對植物安全，不易產生藥害，對環境安全[21]。

本試驗中利用初步制備的HL-1可濕性粉劑進行了盆栽和田間小區除草試驗，其結果表明HL-1可濕性粉劑對繁縷、灰藜、藜和密花香薷4種雜草具有較好除草活性，其中對繁縷和灰藜表現突出。因此，該菌株有望成為田間防除繁縷、灰藜和密花香薷等雜草的生物除草劑，配合使用其他生物菌劑或低量化學除草劑，可應用于小麥和蠶豆田中。

微生物除草劑的評價主要依據有效性和穩定性兩條標準[30,31]。根據國內外成功研制生物除草劑的經驗，下一步有必要對菌劑的濕潤性能、低溫穩定性、熱貯穩定性及抗紫外性能等物理性能進行測定，同時進行生防菌劑田間應用試驗，確定生防菌劑對作物的安全性和對主要農田雜草的防除效果及生防菌劑-微(低)量除草劑結合后的除草效果。

4 結論

生防內生菌HL-1菌株的最適碳源為蔗糖，最適氮源為酵母浸粉，最適固體發酵基質為麥麩，最適載體與助劑為硅藻土、膨潤土、羧甲基纖維素和可溶性淀粉。以HL-1菌株固態發酵獲得的菌粉為有效成分制備成可濕性粉劑，在盆栽與小區試驗中對繁縷、灰藜、藜和密花香薷4種雜草均表現出較強的致病性。HL-1菌株可濕性粉劑盆栽試驗中對繁縷和灰藜的致病率分別是85.50%和68.00%，鮮重效分別是84.74%和65.05%，小區試驗中對繁縷和灰藜的致病率分別是84.50%和79.60%，鮮重效分別是85.36%和73.53%。因此，初步確定該菌株可作為防除繁縷、灰藜、藜和密花香薷等雜草的生物除草劑，有關大田試驗的防除效果需進一步研究。