HPLC法測定藏藥石榴蓮花散中鞣花酸和胡椒堿的含量

1.甘肅省定西市藥品檢驗檢測中心，甘肅 定西 743000；2.甘肅省甘南藏族自治州藥品檢驗檢測中心，甘肅 甘南 747000；3.甘肅省甘南藏族自治州藏醫醫院，甘肅 甘南 747000；4.甘肅省甘南藏族自治州食品檢驗檢測中心，甘肅 甘南 747000

民族醫藥學是我國傳統醫藥的重要組成部分，藏醫藥是我國醫藥寶庫中的瑰寶之一，在藏族人民的防病治病中發揮了不可磨滅的作用，以其獨特的療效越來越被大家關注。石榴蓮花散由石榴子、肉桂、豆蔻、蓽茇、波棱瓜子、黑冰片(炭)、訶子、薔薇花八味中藏藥材組成，具有溫中健胃，消食[1]的功效，用于“培根甲布”病，積食不化，“赤巴”病，“木布”病，胃腸傳染病等[2]。從藏成藥發展概況及現行質量標準研究存在的局限性和相關問題、方劑理論在藏成藥質量標準研究中的指導意義進行探討。當前藏藥標準體系建設相對比較滯后，導致藏藥材生產、加工、管理過程不規范、不統一，優質、穩定、有效、可控的藏藥材原料供給不足，嚴重制約了我省藏成藥產業實現整體轉型升級和提質增效。藏成藥石榴蓮花散現行質量標準收載于《衛生部藥品標準(藏藥第一冊)》(1995年版)，但該標準中只有【性狀】和【檢查】項[3]，缺乏【鑒別】、【含量測定】項目，不能有效控制各組成成分的質量，從而不能有效控制藏藥制劑的質量。本實驗方法采用HPLC法對制劑中石榴子和訶子中鞣花酸進行含量測定，采用HPLC法對制劑中蓽茇的胡椒堿進行含量測定，從而更加有效的控制藏成藥石榴蓮花散的質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀(配四元泵、自動進樣器、紫外檢測器)，Agilent1260高效液相色譜儀(配四元泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器)，Mettler toledo MS205-DU電子分析天平，MettlertoledoEL204-IG電子分析天平，Olympus BX43 CX31光學顯微鏡， GT SONIC-L30超聲波清洗器(廣州固特超聲有限公司)。

1.2 試藥鞣花酸對照品(批號：11959-201602，含量以89.3%計)、胡椒堿對照品(批號：110775-201706，含量以98.9%計)均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純(德國默克公司)；水為屈臣氏蒸餾水；其它所用試劑為分析純。石榴蓮花散樣品10批(來源：甘南藏族自治州藏醫藥研究院4批S1,S2，S3,S4,甘肅省夏河縣藏醫院3批S5，S6，S7，甘肅省碌曲縣西倉寺院藏醫院3批S8，S9，S10)。

2 方法與結果

2.1 鞣花酸的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取鞣花酸對照品適量，加甲醇制成 253.2548 μg/mL的溶液，作為對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液2 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，定容，即得對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取本品1.0 g，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理40 min，放冷，用甲醇補足減失的重量，濾過，取續濾液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇，稀釋、定容至刻度，搖勻,取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 按本品處方及制備工藝制得缺石榴子和訶子的陰性樣品，照“2.1.2”項供試品制備方法處理，即得缺石榴子和訶子的陰性對照溶液。

2.1.4 色譜條件與系統適用性[4-6]色譜柱：Agilent 5 HC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相：乙腈-0.2%磷酸(15∶85)；檢測波長：254 nm；進樣量10 μL；體積流量：1.0 mL/min；柱溫30 ℃。

2.1.5 專屬性試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀。結果表明，供試品色譜中在與對照品色譜相應位置上有色譜峰，而陰性對照色譜中在與對照品色譜相應位置上則未檢測到峰，對測定結果無干擾，見圖1。

2.1.6 線性關系考察 分別精密吸取上述“2.1.1”對照品儲備溶液1、2、3、5mL于50 mL量瓶中，2 mL于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10 μL注入色譜儀，在“2.1.4”相色譜條件下測定。以峰面積為縱坐標(Y)，質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得到回歸方程為Y=108.45X-118.17(r=0.999 9)，5.065～25.325μg范圍內線性關系良好。

2.1.7 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL注入色譜儀，按“2.1.4”色譜條件連續進樣6次，測定鞣花酸峰面積，計算其RSD=0.38%(n=6),表明該測定方法精密度良好。

2.1.8 穩定性試驗 取供試品溶液(樣品S2)，按含量測定方法分別在0、2、4、6、8、12 h測定其鞣花酸含量。結果6次測定鞣花酸平均質量分數為0.3130%，RSD=1.29%(n=6)。結果表明，樣品溶液在12 h內穩定。

2.1.9 重復性試驗取 同一批樣品(樣品S2)，按“2.1.2”方法制備供試品溶液，共6份，按含量測定方法測定其鞣花酸含量。結果6份供試品中鞣花酸平均質量分數為0.290%，RSD=1.28%(n=6)。結果表明，該測定方法重復性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗 取已知鞣花酸含量的同一批樣品0.4 g(樣品S2)，精密稱定，平行6份，分別精密加入鞣花酸對照品儲備溶液(253.2548 μg/mL)5 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入色譜儀，在2.1.4色譜條件下測定，計算加樣回收率，結果見表1。實驗結果表明該含量測定方法的加樣回收率符合要求。

表1 石榴蓮花散中鞣花酸加樣回收率試驗

2.1.11 樣品含量測定 取10批石榴蓮花散樣品，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液。精密吸取上述供試品溶液及鞣花酸對照品溶液各10 μL注入色譜儀，在“2.1.4”色譜條件下測定鞣花酸的質量分數，結果見表2。

表2 10批石榴蓮花散樣品中鞣花酸、胡椒堿含量測定結果

2.2 胡椒堿的含量測定[7-8]

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取胡椒堿對照品適量置棕色容量瓶中，加甲醇制成 104.1417 μg/mL的溶液，作為對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，定容，即得對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備[9]精密稱取本品1.0 g，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理40 min，放冷，用甲醇補足減失的重量，濾過，取續濾液即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按本品處方及制備工藝制得缺蓽茇的陰性樣品，照“2.2.2”項供試品制備方法處理，即得缺蓽茇的陰性對照溶液。

2.2.4 色譜條件與系統適用性 色譜柱：Agilent 5 HC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相：乙腈-水(40：60)；檢測波長：343 nm；進樣量10 μL；體積流量：1.0 mL/min；柱溫30 ℃。

2.2.5 專屬性試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀。結果表明，供試品色譜中在與對照品色譜相應位置上有色譜峰，而陰性對照色譜中在與對照品色譜相應位置上則未檢測到峰，對測定結果無干擾，見圖2。

2.2.6 線性關系考察 分別精密吸取上述“2.2.1”對照品儲備溶液1、2、3、5 mL于50 mL棕色容量瓶中，取2 mL于25 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL注入色譜儀，在“2.2.4”相色譜條件下測定。以峰面積為縱坐標(Y)，質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得到回歸方程為Y=72.128X-0.5195(r=1.000 0)，10.414～52.071μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.7 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL注入色譜儀，按“2.2.4”色譜條件連續進樣6次，測定胡椒堿峰面積，計算其RSD=0.42%(n=6)，表明該測定方法精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗 取供試品溶液(樣品S3)，按含量測定方法分別在0,2,4,6,8,12 h測定其胡椒堿含量。結果6次測定胡椒堿平均質量分數為0.121%，RSD=0.22%(n=6)。結果表明，樣品溶液在12 h內穩定。

2.2.9 重復性試驗 取同一批樣品(樣品S3)，按“2.2.2”方法制備供試品溶液，共6份，按含量測定方法測定其胡椒堿含量。結果6份供試品中胡椒堿平均質量分數為0.119%，RSD=0.58%(n=6)。結果表明，該測定方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取已知胡椒堿含量的同一批樣品0.4 g(樣品S3)，精密稱定，平行6份，分別精密加入胡椒堿對照品儲備溶液(104.1417 μg/mL)5 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入色譜儀，在“2.2.4”色譜條件下測定，計算加樣回收率，結果見表3。實驗結果表明該含量測定方法的加樣回收率符合要求。

表3 石榴蓮花散中胡椒堿加樣回收率試驗

2.2.11 樣品含量測定 取10批石榴蓮花散樣品，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。精密吸取上述供試品溶液及胡椒堿對照品溶液各10 μL注入色譜儀，在“2.2.4”色譜條件下測定，結果見表2。

3 討論

方法選定過程中，石榴蓮花散方中8味藥，石榴子為主藥，通過查閱大量文獻資料顯示，石榴子中主要特征成分有石榴酸，鞣花酸等，但石榴酸是共軛三烯酸，其性質不穩定，存在同分異構體，易氧化成醛、酮、酸、醇和環氧化物等易揮發的小分子物質，且已有大量文獻研究采用HPLC法測定石榴籽中鞣花酸等鞣質成分的含量[10]，色譜條件成熟，訶子中主要特征成分也有鞣花酸，故本實驗選擇研究具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒等藥理作用的鞣花酸為對照，進行其含量測定，制定其質量標準。本實驗用甘南州藏醫院提供的單味藥材模擬石榴蓮花散配方制成自配樣，用建立的實驗方法測定自配樣和石榴子、訶子單味中的鞣花酸含量，結果表明，自配樣中鞣花酸含量為石榴子和訶子單味中的總和。因此考慮建立高效液相色譜方法同時測定石榴子與訶子中鞣花酸的含量 。

過程中應注意，蓽茇中主要活性化學成分是胡椒堿，其具有抗氧化、免疫調節、抗腫瘤等作用。胡椒堿對光十分敏感，易發生光化學歧化作用產生異構體。因此本實驗采用高效液相色譜法測定蓽茇中胡椒堿的含量時，在取樣后加入溶媒超聲提取、過濾、稀釋等實驗操作過程中要特別注意避光，以確保實驗結果的準確性。

實驗中采用二極管陣列檢測器對被測成分鞣花酸、胡椒堿的純度進行了驗證，結果與對照品光譜圖一致，說明被測峰基本為單一物質。

本實驗供試品溶液的制備方法中，供試品超聲提取時間的選擇試驗了30 min、40 min、50 min，超聲時間30 min的待測成分含量較低，超聲時間40 min和50 min的待測成分含量較高，且相差不大，表明超聲40 min待測成分已基本提取完全，因此選擇超聲提取時間為40 min。

綜上，在現有試驗條件下，本實驗建立的高效液相色譜法測定鞣花酸和胡椒堿含量的方法，供試品制備前處理操作簡便，結果準確、重復性好，專屬性高，結果可靠，可有效控制藏成藥石榴蓮花散的質量。