銅錘白花膠囊安全性評價研究

付開聰1 崔明筠1* 羅 健1 付麗紅2 倪 凱 高 敏

1.普洱市民族傳統醫藥研究所，云南 普洱 665000；2.上海中醫藥大學，上海 201203；3.云南省中醫中藥研究院，云南 昆明 650000

腰椎間盤突出癥是指腰椎間盤在受外力作用下，髓核從破裂處脫出，壓迫腰椎的神經根，從而引起腰痛、下肢放射性疼痛和皮膚麻木、發涼、皮溫下降、小便刺痛等一系列臨床癥狀，該病在人群中較為常見，由于缺少有效的治療方法，一旦患上，將嚴重影響患者的正常生活[1-2]。為尋求有效的治療方法，普洱市民族傳統醫藥研究所從哈尼族民間挖掘到一劑特效驗方，后經普洱市民族醫院研究開發成院內制劑銅錘白花膠囊，該制劑經臨床驗證對腰椎間盤突出癥及腰腿疼痛的病癥具有特殊功效[3]。

處方主要由民族藥小銅錘、白花丹和中藥細辛、三七、蜈蚣、蝎子等19味藥材組成，19味藥材君臣佐使搭配合理，相輔相成，增強療效，起到了療傷、止痛、疏通經絡的作用。方中含有細辛、蜈蚣、全蝎和土鱉蟲等4味毒性藥材，該民族醫藥處方在普洱市民族醫院臨床使用超過5年，先后收集到125份臨床觀察病例，患者未出現過臨床不良反應，為進一步探究銅錘白花膠囊的安全性，普洱市民族醫院聯合云南省中醫中藥研究院，開展了銅錘白花膠囊對大鼠的長期毒性實驗研究，為民族醫藥制劑銅錘白花膠囊臨床安全應用，提供了參考依據。

1 實驗儀器、材料及動物

1.1 儀器 SQP型電子分析天平(德國賽多利斯)；小鼠灌胃器[東西儀(北京)科技有限公司]；RM2235切片機(上海徠卡儀器有限公司)；SYSMEX XT-1800i全自動動物血液分析儀(日本希森美康公司)；Qlympus Au5400全自動生化分析儀(日本奧林巴斯有限公司)。

1.2 材料 銅錘白花膠囊，每粒裝0.45 g(普洱市民族傳統醫藥研究所，1次5粒，1日3次，日服用量為13.65 g；飲用水(昆明珍茗食品有限責任公司)；試劑盒(南京建成生物工程研究所)；鼠料和玉米芯墊料(蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司)。

1.3 動物體重范圍 60～80 g 的SPF級大鼠162只，雌雄各半，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。

2 方法

2.1 動物分組和給藥 采用分層分組法，對162只大鼠，隨機分為飲用水對照組、銅錘白花膠囊低(3g·kg-1·d-1)、中(6g·kg-1·d-1)、高(12g·kg-1·d-1)劑量組共4組，除對照組30只外，銅錘白花膠囊組每組44只，雌雄各半。連續灌胃銅錘白花膠囊3個月，依照雌雄各半，第13周隨機抽取20只對照組大鼠，銅錘白花膠囊給藥組大鼠每組抽取26只，實施剖檢。

2.2 觀察指標

2.2.1 一般情況 每天觀察對照組和銅錘白花膠囊給藥組大鼠的一般狀態，每周1次體重和耗料量測定，停藥4周后剖檢剩余動物。觀察銅錘白花膠囊給藥期間和給藥后恢復期大鼠的毒性反應，每周稱量1次大鼠體重和平均進食量，每只動物每周攝食量以平均值記。

2.2.2 血液檢查 給藥結束后和恢復期結束，測定對照組和銅錘白花膠囊給藥組大鼠的血紅蛋白含量、紅細胞數、紅細胞平均體積、紅細胞平均血紅蛋白濃度、血小板數及白細胞計數等指標。

2.2.3 血液生化指標 給藥結束后和恢復期結束，測定對照組和銅錘白花膠囊給藥組大鼠的谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總蛋白、總膽紅素等肝功指標，尿素等腎功指標，葡萄糖膽固醇等生化指標。

2.2.4 病理學檢查 給藥結束后和恢復期結束，剖檢對照組和銅錘白花膠囊給藥組大鼠，觀察雌雄大鼠的肝肺腎等主要器官的濕重，計算臟器系數；并用10%中性福爾馬林液對大鼠臟器做固定處理，再對其進行石蠟包埋切片，鏡檢。

2.2.5 數據處理方法 數據用SPSS軟件16.0處理，計量資料符合正態分布，方差齊者采用T檢驗，方差不齊采用T′檢驗；計量資料不符合正態分布，采用秩和檢驗，各組與對照組進行比較，P<0.05表示數據有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 對一般情況的影響 實驗期間，對照組和銅錘白花膠囊給藥組大鼠未監測到大鼠異常行為，精神狀態和飲食活動正常。給藥結束與恢復期結束，銅銅錘白花膠囊組進食量與飲用水空白對照組比較，進食量稍微減少，但不存在顯著性差異(P>0.05)屬于正常范疇，見表1。錘白花膠囊低、中、高劑量組雌雄動物體重與對照組比較出現動物體重增長緩慢，但在恢復期攝食量和體重增長恢復正常。見表2。

表1 給藥對SD大鼠進食的影響 (g)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

時間性別對照組低劑量組中劑量組高劑量組13 周雌282.35±22.06263.53±20.21*260.61±16.72**254.81±18.48**雄478.71±32.36456.94±33.44429.39±43.83**424.53±34.35**17周雌300.64±22.98286.37±23.04 278.20±14.68 263.37±15.53**雄522.94±45.33497.39±23.76479.41±57.46462.93±32.49*

注：與空白對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

3.2 血液學檢查 由表3可知，灌胃13周結束時，銅錘白花膠囊組大鼠白細胞、血紅蛋白計數和活化部分凝血活酶時間，與空白對照組比較差異無統計學意義 (P>0.05)；其余銅錘白花組血液學檢查指標和對照組比較可見統計學意義的增加或減少，銅錘白花膠囊劑量組大鼠的血液學指標，未見明顯劑量時間依賴關系，綜合上述結果，故認為是由動物個體差異所致[4-5]；恢復期結束，各劑量組動物血液學指標與對照組比較未見統計學差異。因此連續灌胃給予銅錘白花膠囊不會影響大鼠的血液學指標。

3.3 血清生化學檢查 由表4可知，灌胃13周結束時，銅錘白花膠囊組大鼠谷丙轉氨酶、血糖、尿素、肌酐、與空白對照組比較不存在顯著性差異，無統計學意義 (P>0.05)；銅錘白花膠囊組大鼠總膽紅素、總蛋白、總膽固醇值和和空白對照組比較可見統計學意義的增加或降低；恢復期結束，錘白花膠囊組大鼠總膽紅素、總蛋白、總膽固醇值和空白對照組比較未見顯著性增加或降低，大鼠血清生化學指標和銅錘白花膠囊灌胃劑量未形成明顯量效關系，考慮認為是由動物個體差異所致出現統計學差異，未構成毒理學意義，說明指標的變化不是由藥物毒性反應引起的[6-7]。

項目時間對照組低劑量組中劑量組高劑量組白細胞計數/109/L13周5.17±3.076.75±2.466.86±2.856.77±2.3017周7.09±3.227.14±3.216.68±3.205.43±1.68淋巴細胞百分數/%13周64.86±15.8767.33±6.72 69.25±17.2769.98±6.12 17周67.15±8.15 65.39±9.12 65.94±6.78 64.22±8.50 淋巴細胞計數 /109/L13周3.47±2.474.48±1.46 4.87±2.13*4.80±1.8317周4.67±2.054.62±2.354.44±2.263.50±1.21紅細胞計數/109/L13周7.61±0.82 7.12±0.55*7.65±0.63 7.17±0.54*17周7.84±1.568.14±1.017.84±0.657.71±0.81血紅蛋白/g/L13周136.45±26.92 132.77±10.25 141.38±10.94 134.15±8.63 17周143.50±25.84 147.00±15.14 146.35±10.75 142.76±13.25 血小板總數/109/L13周631.15±254.04 815.73±133.29**727.50±170.20742.88±146.3117周906.08±218.14882.31±271.21807.18±294.63762.00±325.05凝血酶原時間/s13周13.1±3.4612.36±2.32 15.31±3.46*12.89±3.00 17周15.4±4.0212.39±2.28*13.35±3.3813.65±3.56活化部分凝血活酶時間/s13周23.11±3.04 24.20±2.3 25.04±3.84 21.80±1.46 17周24.83±2.5125.59±3.1925.37±2.6823.46±2.36

注：與空白對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

項目時間對照組低劑量組中劑量組高劑量組總膽紅素/umol/L13周0.73±0.401.03±0.34*0.97±0.37*0.68±0.3117周2.05±0.631.58±0.39*1.62±0.491.69±0.30總蛋白/g/L13周71.69±2.92 67.95±5.55**70.39±4.00 69.53±4.60 17周72.66±4.5672.27±5.0269.89±5.8973.22±5.80 谷丙轉氨酶/ U/L13周43.55±9.62 42.77±10.52 39.23±6.96 53.38±35.5917周61.70±24.2854.56±16.67 54.24±22.98 49.82±14.34谷草轉氨酶/U/L13周169.00±50.76 136.62±39.73* 145.19±37.45 165.85±77.82 17周198.40±158.78216.00±155.43 183.24±119.80 201.76±102.03血糖/mmol/L13周4.96±0.815.14±0.53 5.24±0.82 5.23±0.5217周5.61±1.005.28±0.675.35±0.545.25±0.59尿素/umol/L13周7.22±1.747.18±2.11 6.78±1.63 7.71±2.0217周7.33±0.976.90±1.507.10±1.766.44±1.15肌酐/umol/L13周27.95±12.1822.96±13.24 25.19±9.04 23.23±11.3517周22.20±8.80 20.63±4.81 21.18±6.74 16.24±5.01

續表4

項目時間對照組低劑量組中劑量組高劑量組總膽固醇/mmol/L13周2.16±0.372.01±0.49 2.04±0.27 1.76±0.34**17周1.95±0.282.06±0.34 1.91±0.54 1.92±0.43肌酸激酶/umol/L13周4429.45±3013.74 2617.19±1918.04*3023.27±2417.33 3167.27±2153.2617周2502.10±1785.663793.94±3851.173331.76±2984.444159.35±3569.23

注：與空白對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

3.4 臟器系數和臟器病理組織學檢查 給藥結束后和恢復期結束胃、腦、十二指腸、骨骼肌、睪丸、附睪、子宮、卵巢、前列腺、腎上腺、甲狀腺、食管、主動脈、膀胱、胸腺、皮膚、骨髓、脊髓、氣管、心、脾、腸系膜淋巴等器官組織未觀察到與受試物有關的改變。

項目時間對照組低劑量組中劑量組高劑量組胸腺13周0.102±0.0280.124±0.0310.124±0.0250.107±0.01817周0.106±0.0280.095±0.020.090±0.0250.103±0.048腎上腺13周0.026±0.0030.028±0.0180.025±0.0040.024±0.00617周0.024±0.0040.025±0.0060.026±0.0030.024±0.005子宮13周0.209±0.0460.296±0.082**0.273±0.054** 0.318±0.073**17周0.260±0.0410.317±0.0980.324±0.0940.359±0.139卵巢13周0.049±0.0090.052±0.0080.055±0.0090.085±0.12317周0.055±0.0080.077±0.0750.052±0.0100.053±0.012心13周 0.32±0.0330.346±0.0270.339±0.032 0.360±0.030**17周0.364±0.0590.344±0.0410.340±0.0270.365±0.039肝13周2.588±0.1773.121±0.278**3.164±0.220** 3.338±0.207**17周2.745±0.2873.109±0.273*2.913±0.2052.957±0.216脾13周0.188±0.0190.211±0.028*0.200±0.0230.207±0.02517周0.239±0.0620.195±0.0310.196±0.0140.207±0.029腎13周0.630±0.0460.702±0.042*0.737±0.095** 0.717±0.037**17周0.669±0.0340.670±0.0420.663±0.0320.688±0.049腦13周0.734±0.0600.774±0.0530.774±0.0640.763±0.06517周0.713±0.0500.701±0.1070.733±0.0580.748±0.027

注：與空白對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

項目時間對照組低劑量組中劑量組高劑量組胸腺13周0.090±0.0170.079±0.0160.084±0.024 0.071±0.017*17周0.064±0.0090.074±0.0170.067±0.0160.079±0.025腎上腺13周0.015±0.0030.014±0.0020.014±0.0020.015±0.00317周0.013±0.0010.014±0.0030.013±0.0030.014±0.002睪丸13周0.750±0.0770.694±0.1610.845±0.069**0.786±0.22717周0.735±0.0860.784±0.0580.787±0.0700.822±0.061附睪13周0.319±0.0260.293±0.0550.341±0.0530.274±0.08117周0.355±0.0480.339±0.0300.339±0.0590.351±0.071

續表6

項目時間對照組低劑量組中劑量組高劑量組心13周0.335±0.021 0.313±0.028*0.359±0.0350.328±0.03017周0.316±0.0560.375±0.1190.314±0.0400.335±0.034肝13周 2.579±0.272 2.863±0.230* 3.007±0.166** 3.124±0.306**17周 2.724±0.175 2.724±0.331 2.810±0.2282.980±0.361脾13周 0.174±0.034 0.160±0.014 0.156±0.0170.162±0.01417周 0.146±0.023 0.149±0.024 0.156±0.020.160±0.034腎13周 0.617±0.072 0.704±0.065** 0.750±0.064**0.708±0.17517周0.0595±0.047 0.636±0.048 0.675±0.057* 0.705±0.04**腦13周 0.440±0.060 0.458±0.048 0.509±0.058 0.516±0.082*17周 0.411±0.034 0.425±0.043 0.450±0.0700.447±0.015*

注：與空白對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

由表5～6的數據分析，結合對照組和銅錘白花膠囊組大鼠器官濕重、體重、病理結果和臟體比系數的變化進行分析，給藥結束時，與對照組比較，銅錘白花膠囊組大鼠臟體比系數均增加或降低的生物學意義較大，但缺少劑量和時間依賴性，且器官組織未觀察到與受試物有關的改變，說明臟器指標的變化可能不是藥物特異性毒性損傷；恢復期結束，雌性大鼠臟體比系數無明顯變化，雄性大鼠肝腦腎臟體比系數升高，結合大鼠尿液檢查、病理組織檢查，可視為不是毒性靶器官[8]。

4 討論

長期毒性試驗是藥物臨床前安全性評價采取的主要研究方法，文中研究試驗，通過將銅錘白花膠囊按照臨床用藥途徑大劑量重復多次給予動物，密切檢測動物產生的毒性反應和中毒靶組織器官，獲得毒性產生的量效和時效關系，預測了銅錘白花膠囊在臨床上可能出現的毒性反應性質及發生率，對銅錘白花膠囊的臨床應用具有重要的參考意義。

銅錘白花膠囊對大鼠長期毒性實驗結果顯示，給藥期與恢復期結束時，銅錘白花膠囊低、中、高劑量組大鼠一般狀況良好，其活動，飲食，飲水正常，與對照組比較體重部分時期增長緩慢，但在恢復期攝食量和體重增長恢復正常，其它各項臨床檢驗未見與銅錘白花膠囊灌胃劑量形成明顯量效關系，且銅錘白花膠囊組大鼠各器官組織均未觀察到與給藥明顯相關的組織形態學改變，綜合以上研究數據說明在長期毒性實驗條件下，銅錘白花膠囊對大鼠是安全的，為民族藥銅錘白花膠囊的臨床應用提供了安全性評價依據。