多菌種純種微生物在綿柔型芝麻香白酒中的應用

張建良，于飛躍，楊海波，李 行

（江蘇乾隆江南酒業股份有限公司，江蘇宿遷 201700）

白酒是我國的傳統優勢食品，產業規模較大、經濟貢獻率較高，是食品工業的支柱產業之一。近年來，我國白酒行業盡管受到諸多因素的影響，但仍保持了較快的發展勢頭，未來白酒產業的經濟發展仍將保持穩定的增長[1]。隨著經濟的高速發展，人際交往越為密切和頻繁。這種背景下促進了交際主平臺餐飲業的爆發性成長。無酒不成席，酒不僅是傳統意義上的一種飲用享受(享受型消費)，也是中國人社交禮儀的重要道具(交際型消費)。近幾年，隨著消費者健康保健意識的增強，白酒消費已明顯出現低度化、清淡化、健康化、綿柔化的趨勢，正是這種飲酒與健康的矛盾，給綿柔型芝麻香白酒帶來了極大的發展機遇[2]。微生物菌群在白酒釀造過程中起著重要作用，它是酒體質量、產量的重要保證。主要包含霉菌、細菌和酵母菌三大類[3-4]。本研究從芝麻香大曲、糧醅和酒醅中篩選分離出1 株耐高溫酵母和3 株高溫細菌，經馴化和純菌種培養，用于綿柔型芝麻香白酒的制曲。又采用多糧高氮配料和高溫發酵工藝，促進了功能因子的生成，提升了綿柔型芝麻香白酒酒體口感的綿柔度、豐滿度和綜合品質。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

樣本：用于菌株分離的芝麻香大曲、糧醅、酒醅，源于本公司。

原輔料：高粱、小麥、麩皮、大米、糯米、玉米等由本公司采購。

儀器設備：2 cm 50/30 μ m 固相微萃取三相頭divinylbenzene/carboxen/poly(dimethylsiloxane)(DVB/CAR/PDMS)購于上海Sigma-Aldrich 貿易有限公司；水為Milli Q 超純水(Millipore，Badford，MA，USA)；全二維氣相色譜-飛行時間質譜儀(GC×GC-TOFMS，Pegasus 4D，LecoCorporation，USA)，其中GC × GC 系統由安捷倫7890N 氣相色譜和冷噴調制器KT-2001 組成，質譜檢測器為美國LECO Pegasus 4D飛行時間質譜。

1.2 試驗方法

1.2.1 優勢菌株篩選

采用平板劃線法和稀釋涂布法：分離樣品經富集培養，適當稀釋后平板劃線或稀釋涂布，挑選單菌落。酵母菌篩選時富集溫度為45 ℃，為避免細菌和霉菌之間的干擾，富集時在培養基中分別加入100 mg/L 的氨芐青霉素和制霉素。細菌富集溫度為65 ℃。

1.2.2 強化制曲

優勢菌株分別進行純培養，按比例混合復配，接入制曲料中，按傳統方法進行制曲，制曲溫度控制在65～70 ℃。

1.2.3 多糧高溫發酵

高粱、小麥、麩皮、大米、糯米、玉米按比例混合，接入純培養技術制成的綿柔型芝麻香白酒復合多微功能曲，通風堆積發酵48 h，轉入窖池發酵36 d。

1.2.4 風味物質成分分析

頂空固相微萃取(HS-SPME)：取2 mL 白酒樣品，8 mL 超純水及3.0 g 氯化鈉于20 mL 頂空瓶混合均勻，用帶PTFE/藍色硅膠隔墊的空心磁性金屬蓋密封后由MPS 2 進行HS-SPME，實驗過程參照文獻方法[5]。HS-SPME 萃取及進樣過程由Gerstel 公司多功能自動進樣系統(MPS 2)完成，萃取頭為2 cm 50/30 μ m DVB/CAR/PDMS 三相萃取頭。萃取溫度50 ℃，樣品平衡時間5 min，萃取時間50 min，乳化器轉速500 r/min。完成萃取過程后萃取頭于GC 進樣口250 ℃解吸附5 min，進行GC×GC-TOFMS分析。

全二維氣相色譜、飛行質譜（GC×GC-TOFMS）分析：一維色譜柱DB-5MS(30 m×0.25 mm ID，0.25 μ m)，二維色譜柱Rxi-200(1.5 m × 0.18 mm ID,0.2 μ m)色譜條件：GC 進樣口溫度250 ℃，進樣模式采用不分流模式進行。第一維柱溫箱升溫程序：起始溫度40 ℃保持2 min 后，以5 ℃/min 升溫至230 ℃保持5 min。調制器調制時間為4 s，熱調制時間為1 s，調制補償溫度為20 ℃。第二維柱溫箱升溫程序：起始溫度60 ℃保持2 min，后以5 ℃/min 升溫至250 ℃保持5 min。樣品運行采用恒流模式，載氣為高純氦氣(純度＞99.9995 %)，流速為1 mL/min。

圖1 優勢菌株分離

質譜條件：EI 離子源，電壓為70 eV，離子源溫度為230 ℃，傳輸線溫度為280 ℃。檢測器電壓為1365 V。采集質量數范圍為35～500 amu，采集頻率為100 spectrum/s。數據采集由LECO 公司Pegasus 4D工作站控制。

GC×GC-TOFMS 數據處理：實驗采集的TOFMS 數據由美國力可（LECO）公司ChromaTOF工作站進行數據處理，自動識別信噪比大于50 的色譜峰后進行自動積分解卷積和質譜庫比對，質譜庫為NIST 14 和Wiley 9，所有比對結果自動生成峰形圖譜。峰形圖譜經過進一步人工解譜及同系物二維色譜出峰規律比對驗證后作為初步鑒定結果。最后剔除烷烴類等沒有風味貢獻的化合物，選擇相似度大于800，反相似度大于800，可能性大于4000的化合物作為最終鑒定結果。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選與分離

芝麻香大曲、糧醅和酒醅為分離樣品，采用高溫富集馴化、平板稀釋劃線的方法進行菌株的分離，獲得了1 株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、1 株耐酸乳桿菌(Lactobacillus acetotolerans)、1株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和1 株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），部分結果見圖1。

該酵母菌耐高溫，可以在50 ℃生長，產醇產酯能力強；兩株芽孢桿菌可以在70 ℃生長，產淀粉酶活力較高；乳酸菌具有較高的耐酸能力。微生物菌群是釀造的靈魂，黃淮流域獨特的區域優勢造就了獨特的釀造微生物。上述核心功能微生物分離于芝麻香的大曲、糧醅和酒醅，將其應用到綿柔型芝麻香白酒的生產中，有利于綿柔型芝麻香白酒獨特風格和功能因子的形成，提升產品品質。

2.2 多菌株純培養強化制曲

將上述4 株菌分別進行純培養，按一定比例混合，與傳統芝麻香麩曲工藝相結合，進行強化制曲。基于純培養菌株的耐熱特性，制曲溫度可以從傳統的62 ℃提高到65～70 ℃，有效抑制了雜菌的生長，為綿柔型芝麻香白酒典型風味物質和功能因子的形成奠定了生態基礎。綿柔型芝麻香白酒復合多微功能曲，是多菌種純培養技術的成功應用，它能夠使釀造性能穩定，精準控制微生物，大幅度提高綿柔型芝麻香白酒酒體口感的綿柔度、豐滿度，調控白酒質量，增加白酒風味物質和功能因子，提升白酒口感舒適度和利于健康的有益成分。

2.3 多糧高溫發酵

以高粱和小麥為主原料，麩皮、大米、糯米、玉米為輔料合理配比，接入純培養技術制成的綿柔型芝麻香白酒復合多微功能曲，高溫兩段式發酵。

第一段采用開放式發酵（堆積發酵），更大限度的增加微生物與空氣的接觸面，使微生物代謝更加旺盛，保證重要風味物質及其前體物質的形成。第二階段采用密閉式發酵（窖池發酵），通過控制入池溫度、分層踩窖及使用窖池專用布泥封窖池等方式，優化入池工藝參數，實現對酒醅功能微生物結構和功能的定向調控，保證綿柔型芝麻香白酒獨特風格的形成。

經實踐表明，輔料整粒投料有助于提升酒醅的骨力，有利于促進微生物的生長和發酵，并且將原輔料用熱水浸泡，有助于原輔料吸水糊化，在蒸煮時，采用谷糠放在原輔料上一起清蒸，能夠有效去除原輔料上的邪雜味，同時原料也達到了一定程度的糊化，利于培菌糖化。堆積結束后，溫度設置為40～45 ℃，有助于正常發酵、產酯，產出的酒與現有的芝麻香型相比，入口圓潤醇和，無雜味，細膩豐滿，具有明顯的感官特征和獨特的個性。采用熱水泡糧及原料清蒸，有助于高粱淀粉吸水糊化，蒸煮時易透心，有利于醇甜物質生成，能夠有效排除因混合蒸燒而帶來的生料味及異雜味，又可以提升酒質的純凈度和口感的爽凈度。與現有技術相比，采用多菌株純培養高溫發酵工藝，產出的酒香氣幽雅飄逸，入口綿柔醇厚，無雜味，具有明顯的感官特征和獨特的個性。

2.4 風味物質成分分析

二維氣相色譜解決了一維色譜峰容量低、分離度不好的問題。本文采用全二維氣相色譜-高分辨質譜，從綿柔型芝麻香白酒中共檢測到517 種揮發性組分，其中酯類145 種，醇類69 種，酸類25 種，醛、酮、縮醛類92 種，含氮組分25 種，呋喃類32 種，烯萜類17種，其他89種。

2.4.1 主要風味物質

白酒中的有機酸、醇、酯、醛酮成分是主要風味物質[6]。采用氣相色譜法分析綿柔型芝麻香白酒的揮發性成分，結果見表1。由表1 可以看出，綿柔型芝麻香白酒有機酸種類和含量較高，總醇的含量較高，醛、酮類化合物的總量較高，酯類化合物種類多。較高的多元醇含量與適當的酸含量是綿柔型芝麻香白酒典型風格的物質基礎。

2.4.2 含硫化合物

揮發性含硫化合物由于其極低的香氣閾值和獨特的香氣特征，成為食品中一類十分重要的香氣物質，在食品風味化學研究中受到廣泛關注[7]。但由于揮發性含硫化合物化學結構多樣，性質不穩定，大多在食品中濃度低，因此很難被檢測到。本文利用全二維氣相色譜-TOF 質譜，采用頂空萃取進樣的方式，從綿柔型芝麻香白酒中檢測到23 種含硫化合物，如表2 所示，其中17 號3，4-二甲基噻吩首次從白酒中檢測到。這些硫化物的檢出對進一步研究揮發性組分對構成綿柔型芝麻香白酒獨特的香氣特征具有重要作用。

綿柔型芝麻香白酒的指紋譜見圖2。從指紋譜分析可以看出，綿柔型芝麻香白酒中的揮發性成分與清香型、濃香型和醬香型相似，包含了大部分含硫指紋譜峰，與醬香型白酒相似度更高。圖中的指紋譜峰標號為表2 中含硫化合物的序號。盡管綿柔型芝麻香白酒與醬香型白酒揮發性成分相似，但是含硫指紋譜色譜峰更加豐富，同時與其他香型的指紋譜峰相比，相同的指紋譜如3 號、6 號、8 號和13 號，綿柔型芝麻香中的含量和比例與其他3 種香型的白酒也不同。正是由于所含有的特征組分和含量的不同，導致綿柔型芝麻香白酒特殊的口感和功效。

表1 綿柔型芝麻香白酒主要風味成分分析表 (mg/L)

表2 綿柔型芝麻香白酒揮發性含硫組分表

圖2 不同香型白酒揮發性化合物指紋圖譜比較

2.4.3 萜烯類化合物和吡嗪類化合物

萜烯類化合物既是構成白酒香氣特征的一類重要香氣化合物，也是白酒中重要的生理活性物質，同時作為功能性組分，具有較強的抑菌活性和抗凝血活性[8]。吡嗪類化合物是白酒中含氮化合物的主要成分，同時也是白酒香氣成分的重要組成物質，雖然吡嗪類化合物在白酒中含量甚微，但它具有預防心血管疾病作用，對白酒的保健功能起著重要作用[9-10]。本文對綿柔型芝麻香白酒中的烯萜類和吡嗪類組分進行了定量分析，結果如圖3 所示。從圖3 可看出，古云烯、長葉烯、石竹烯、丁子香烯是構成綿柔型芝麻香白酒的主要烯萜成分，總含量為200 μ g/L。2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基、5-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和四甲基吡嗪為主要的吡嗪類化合物，總含量為328 μ g/L。

3 結論

采用多菌株純培養，多糧高氮配料，高溫兩段式發酵生產綿柔型芝麻香白酒，并對產品的風味物質進行了分析，研究得出以下結論：

3.1 應用多菌種純培養技術，釀酒酵母、耐酸乳桿菌、地衣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌經馴化、純菌種培養后按一定比例混合，可以精準控制微生物，穩定釀造性能，促進風味物質和功能因子的形成。

圖3 綿柔型芝麻香白酒主要萜烯類和吡嗪類物質含量分析

3.2 多糧配比，尤其是小麥、麩皮和糯米的添加，形成了微量成分的多樣性，高氮配料可能對吡嗪類化合物的生成有促進作用。

3.3 綿柔型芝麻香白酒的風味物質雖然與醬香型白酒更接近，但含硫化合物、萜烯類化合物和吡嗪類化合物的種類和含量并不相同。