耐酸酵母菌株的篩選及其在醬香白酒釀造過程中的應用研究

盧 君，山其木格，唐 平，王 麗，孟天毅，梁青松，張 樂，馮國躍，李長文

（1.貴州國臺酒業有限公司，貴州仁懷 564501；2.天士力控股集團有限公司研究院，天津 300410）

醬香型白酒由于其獨特的釀造工藝和釀造環境，形成了發酵過程中特殊的微生物區系，而酵母菌群與醬香白酒的產量和質量都有極為密切的關系[1-2]。參與醬香白酒釀造的酵母菌群種類多樣，熊子書和周恒剛在茅臺試點實驗時分離出了卡爾斯伯酵母、粟酒裂殖酵母、釀酒酵母、白地霉、假絲酵母、球擬酵母、畢赤酵母、擲孢酵母等[3-5]。從功能上講，酵母菌群主要起到產酒、產香和產多元醇等作用[6]。

醬香白酒發酵過程的糟醅是一種非常復雜的基質，酵母菌的生長代謝易受到糟醅酸度、水分、糖分、淀粉、代謝副產物、疏松度、含氧量等多方面指標的影響。近些年來，由于茅臺鎮有時會出現極端的天氣情況，導致了個別年份茅臺鎮醬酒企業的普遍減產，損失慘重。這其中主要表現為2 輪次糟醅酸度過高，3 輪次、4 輪次生產掉排。其中重要的原因是糟醅酸度降至pH≤4.5 后，酵母菌的生理代謝活動逐漸受到抑制，對發酵原料的轉化利用能力及乙醇的發酵生產能力也逐漸下降，進而導致基酒欠產[7]。因此，篩選具有高耐酸性能的酵母菌株，并強化應用于發酵異常的糟醅中，是解決發酵力不足，基酒產量低的有效途徑之一。

本研究從醬香白酒發酵過程中分離大量酵母菌株，并進行分類鑒定。挑選代表性的菌株進行酸度耐受性篩選實驗，得到高耐酸性酵母，進一步驗證其發酵性能。通過實驗室規模液態發酵實驗、實驗室規模固態發酵實驗、實驗室規模糟醅發酵實驗，驗證得到可靠結論后，最終進行生產規模驗證實驗，并評價耐酸酵母菌株應用于醬香型白酒釀造過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

菌種來源：“國臺酒-酵母菌種庫”中從醬香白酒釀造過程的糟醅和大曲中分離和保藏的酵母屬的菌株共計90株。

材料：高粱、糟醅，均由酒廠提供。

試劑：磷酸二氫鉀，分析純，津威晨化學試劑科貿有限公司；氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈣、三氯化鐵，硫酸錳，分析純，天津威晨化學試劑科貿有限公司；蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、胰蛋白胨，生化試劑，北京奧博星生物技術有限責任公司；乳酸，分析純，無錫市亞泰聯合化工有限公司。

培養基：YEPD 培養基，WL 培養基[7]，TTC 培養基[8]，高粱汁培養基[9]：首先，取500 g 粉碎后的高粱，粉碎度90%，添加到2 L 的去離子水中，同時添加適量的α-淀粉酶溶液；上述混合溶液，經過2 h的蒸煮后，添加適量的糖化酶，接下來在60 ℃的條件下糖化4 h；取上述經過液化和糖化后的混合液，8000 r/min 離心10 min，上清液即為高粱汁培養液；再加水稀釋調整糖度至10 Brix，然后分裝，121 ℃滅菌20 min后，備用。

1.2 儀器與設備

電子天平，上海精密科學儀器有限公司；PCR儀MyCyclerTM Thermal Cycler、凝膠成像系統the Discovery Series 及分析軟件Quantity One 均購自美國Bio-Rad 公司；瓊脂糖電泳裝置the Electrophoresis System DYY-6C，購自北京六一儀器廠；超純水機，法國Millipore 公司；紫外可見分光光度計，HITACHI U3010；顯微鏡，OLYMPUS BX53F；滅菌鍋，山東新華醫療器械股份有限公司；分析天平，METTLER；搖床，上海智誠分析儀器制造有限公司；生化培養箱，天津市天宇實驗儀器有限公司；凈化操作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.3 試驗方法和內容

本研究總體研究方法流程圖如圖1 所示，以下分步描述方法和內容。

圖1 總體研究方法流程圖

1.3.1 酵母菌株的形態分類鑒定

采用WL 培養基進行菌落形態分類[7]、采用顯微鏡觀察細胞形態進行分類。

1.3.2 酵母菌株分子生物學分類鑒定

采用5.8s-PCR-RFLP 分析以及ITS 測序的方法進行分類鑒定[10]。

1.3.3 耐酸酵母菌株的篩選

（1）耐酸實驗用培養基的配制：配制YEPD 液體培養基，以乳酸調酸度至pH2、pH3、pH4、pH5 四個pH 值梯度。每個試管分裝10 mL 培養基，每個樣品做兩個平行，121 ℃高壓滅菌20 min，備用。

（2）不同酸度下酵母菌株生長情況觀察：配制YEPD液體培養基，每個三角瓶分裝25 mL培養基，121 ℃高壓滅菌20 min。待滅菌結束，培養基降溫后，接入酵母菌，28 ℃、150 r/min 搖床培養過夜。次日，用血球計數板觀察培養液菌濃度，根據實際菌濃度，等量接種于不同酸度培養基中，保證不同酸度培養基中最初菌濃度均為106個/mL。接菌后，28 ℃、150 r/min搖床培養15 h。

（3）分光光度計測量：培養液搖勻，取2 mL 菌液，裝入2 mL 離心管，10000 r/min 離心2 min，棄上清液。離心管中加入2 mL 無菌水，懸浮均勻后，即可進行分光光度計測量菌濃度。以無菌水進行調零，測量600 nm處吸光值。

1.3.4 酵母菌株的發酵性能測試

采用TTC 法[8]和杜氏管發酵法[11]進行酵母菌株的發酵性能測試。

1.3.5 耐酸酵母菌株的實驗室液態發酵性能測定

將初篩得的菌株接種高粱汁試管于200 r/min、30 ℃培養獲得種子液；取250 mL 三角瓶裝液量150 mL，接種量均為1×106個/mL。安裝發酵栓封口膜密封，30 ℃靜置培養，期間稱重，發酵終點以日減重量少于0.2 g 為準。發酵結束后記錄發酵時間，檢測發酵液的總酸、還原糖，以及蒸餾液的酒精度、總酸和總酯含量。

1.3.6 耐酸酵母菌株的實驗室固態發酵性能測定

以液化和糖化后的高粱制備固態培養基，菌種接種量、培養方法同1.3.5。發酵結束后檢測糟醅的酸度、還原糖、淀粉含量；以及蒸餾液的酒精度、總酸和總酯含量。

1.3.7 耐酸酵母菌株的實驗室糟醅發酵性能測定

取酒廠釀酒生產時的糟醅作為培養基，菌種接種量、培養方法同1.3.5。發酵結束后檢測糟醅的水分、酸度、還原糖、淀粉含量；以及蒸餾液的酒精度、總酸和總酯含量。

1.3.8 耐酸酵母菌株的生產規模驗證實驗

選擇耐酸、產酒功能明確的酵母菌株，制作成液體培養液，應用于貴州國臺酒業有限公司4 輪次生產時4 個不同班組的堆積和窖池發酵過程中。跟蹤實驗窖池出窖糟醅的理化指標，并且評價實驗窖池基酒產質量情況。

1.3.9 測定分析方法

酸度測定采用酸堿滴定法、糖分和淀粉含量采用斐林滴定法，具體檢測方法參見《白酒生產技術全書》[12]。

蒸餾液酒精度、總酯、總酸：參照GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[13]。

2 結果與分析

2.1 酵母菌株分類鑒定結果

本研究利用形態學分類和分子生物學分類的方法，針對從貴州國臺酒業有限公司釀造過程的糟醅和大曲中分離得到的90 株酵母屬的菌株，分類鑒定為7 個不同的種，在鑒定結果的基礎上，每種分類結果對應的酵母菌株隨機挑選6 株，共計42株，用于后續的耐酸酵母菌篩選實驗，結果見表1。

2.2 酵母菌株耐酸性能篩選

以42 株酵母菌株為出發菌株，活化培養后分別接種于不同酸度的培養基中，培養結束后根據菌體濃度來評價酵母菌株的耐酸性能。結果顯示粟酒裂殖酵母和釀酒酵母的耐酸性能要高于其他種的酵母，同時還觀察到這兩種酵母也是糟醅出窖時的優勢菌株。說明實驗室篩選的耐酸性能結果與釀酒環境自然篩選的結果是一致的。本研究將42株酵母菌株的耐酸性能進行排序，位列前4 位的酵母菌株編號分別為：LJ3、LJ5、NJ2、LJ4。這4 株耐酸菌株在pH2、pH3、pH4、pH5梯度的培養基中的生長情況見圖2。

2.3 酵母菌株發酵性能初步篩選

利用TTC 平板法和杜氏管法，對42 株酵母菌株進行發酵性能的初步篩選。根據菌落顏色（紅色）的深淺和產氣的效果，發現釀酒酵母NJ2 的發酵性能處于前3 位；粟酒裂殖酵母LJ3、LJ5、LJ4 發酵速率較慢，但隨著發酵時間的延長，也表現出較強的發酵性能。考慮到耐酸性能是實驗最關心的，所以確定這4株酵母作為后續發酵實驗的菌株。

表1 酵母菌的菌落菌體形態和RFLP分析鑒定表

圖2 酵母菌株耐酸性能篩選結果

2.4 實驗室液態發酵實驗驗證

將篩選出的4 株耐酸酵母菌株LJ3、LJ5、NJ2、LJ4 活化后，分別接種于高粱汁培養基中，于30 ℃靜置培養，每隔24 h振蕩稱重，記錄失重量，發酵過程的產氣情況見圖3。發酵結束后，檢測發酵液和蒸餾液的理化指標，結果見表2。

由圖3 能夠看出，釀酒酵母NJ2 的發酵速率明顯高于粟酒裂殖酵母LJ3、LJ5、LJ4。兩種酵母表現出了不同的發酵性能，實驗結果認為，這兩種酵母對于醬香白酒發酵都是不可或缺的，既需要發酵速率快的酵母，也需要符合“前緩、中挺、后緩落”規律的酵母菌株，共同參與醬香白酒釀造過程中。

圖3 實驗室液態發酵實驗產氣結果

由表2看出，釀酒酵母NJ2發酵時間更短，而粟酒裂殖酵母LJ3、LJ5、LJ4，雖然發酵時間更長，但是卻表現出了更高的產酒能力。

2.5 實驗室固態發酵實驗驗證

將篩選出的4 株耐酸酵母菌株LJ3、LJ5、NJ2、LJ4 活化后，分別接種于高粱培養基中，于30 ℃下靜置培養，發酵結束后，檢測發酵后高粱和蒸餾液的理化指標結果見表3。

表2 耐酸酵母液態發酵實驗性能指標

表3 耐酸酵母固態發酵實驗性能指標

由表3 看出，固態發酵時，所有酵母表現出比較相似的發酵能力，其中粟酒裂殖酵母LJ3 的產酒能力更強。

2.6 實驗室糟醅發酵實驗驗證

將篩選出的4 株耐酸酵母菌株LJ3、LJ5、NJ2、LJ4 活化后，分別接種于酒廠實際生產時4 輪次的入窖糟醅樣品中，于30 ℃下靜置培養，每隔24 h 振蕩稱重，記錄失重量，發酵過程的產氣情況見圖4。發酵結束后，檢測糟醅和蒸餾液的理化指標結果見表4。

表4 耐酸酵母糟醅發酵實驗性能指標

由圖4 可以看出，利用釀酒過程的糟醅作為培養基，驗證4 種耐酸酵母菌時，發酵速率差異并不大。發酵過程添加了酵母菌株后，相比于原始糟醅，發酵速率都有明顯增加。并且，粟酒裂殖酵母的最高產氣量要高于釀酒酵母。

從表4 能夠看出，利用釀酒過程的糟醅作為培養基，添加酵母后，蒸餾液的酒精度均有明顯提升，總酯的含量小幅提升，其他理化指標差別不大。

圖4 實驗室糟醅發酵實驗產氣結果

2.7 耐酸酵母菌劑生產應用發酵實驗

根據以上實驗室液態、固態、糟醅發酵實驗積累的驗證結果，我們最終選擇應用釀酒酵母NJ2 和粟酒裂殖酵母LJ3 作為強化菌株，兩種酵母培養液按1∶1 比例混合作為耐酸酵母菌劑，從4 個不同班組各選擇1 個窖池作為實驗窖池（該班組其余正常生產的窖池作為對照窖），分別投入4 輪次生產過程的糟醅堆積階段和入窖階段。跟蹤發酵的進程，發酵結束后檢測出窖糟醅的理化指標，見表5，基酒的產量變化見表6。

表5 耐酸酵母菌劑生產應用發酵實驗理化指標

表6 耐酸酵母菌劑生產應用試驗基酒的產量變化

由表5、表6 可看出，在強化了耐酸酵母菌劑之后，出窖糟醅的各項理化指標未見明顯變化。而基酒產量卻有明顯的提高，提高比率在13.47 %～25.97%之間，說明在糟醅發酵力不足時，提高耐酸酵母的生物量對于提升基酒的產量有直接的聯系。對于質量的評價，使用耐酸酵母菌劑后實驗班組的基酒均符合輪次基酒風格特征的要求，除口感略偏甜外，其他風味指標沒有明顯差異。

3 結論

本研究從醬香白酒發酵過程中篩選得到4 株耐酸性能良好的酵母菌株，鑒定結果顯示為1 株釀酒酵母和3 株粟酒裂殖酵母。通過實驗室液態、固態、糟醅發酵實驗，驗證了這4 株酵母菌的發酵性能，優選出釀酒酵母NJ2 和粟酒裂殖酵母LJ3 作為強化菌株，應用于生產的發酵實驗。結果顯示，在強化了耐酸酵母菌劑之后，出窖糟醅的各項理化指標未見明顯變化。而基酒產量卻有明顯的提高，提高比率在13.47%～25.97%之間，基酒質量除口感略偏甜外，其他風味指標沒有明顯差異。本研究篩選到的耐酸酵母菌株和采用的技術，可有效應對茅臺鎮有時會出現極端天氣導致的2 輪次糟醅酸度過高，發酵力不足，3 輪次、4 輪次生產掉排現象。作為一種儲備的應急技術，對于企業來說具有實際的應用意義。