氨基甲酸酯類農藥對蛋白核小球藻聯合毒性作用特點及機制

卞志強，張瑾，王滔，徐晨茗，陶夢婷

安徽建筑大學環境與能源工程學院，安徽省水污染控制與廢水資源化重點實驗室，合肥 230601

氨基甲酸酯類農藥是我國廣泛使用的農藥種類之一[1]，該類農藥的分子結構中含有一個N-甲基基團，是一類以甲酸酯為前體化合物發展而來的農藥，具有人畜低毒、高效和選擇性強等特點[2]，而被廣泛應用于農業生產中。正是由于氨基甲酸酯類農藥的廣泛應用，導致其成為目前水源水中比較常見的有機污染物之一，對環境中生活的生物可能會構成潛在的威脅。有調查研究發現[3]，長江中下游地區作為水稻主產區，廣泛使用氨基甲酸酯類和其他類農藥防治病蟲害，致使這些農藥在此處河水中匯集積累。孫英等[4]研究發現，3種氨基甲酸酯類農藥(乙霉威、甲萘威和克百威)進入生物有機體后有可能通過形成DNA加合物的形式而進一步導致基因突變，進而對生物體的DNA產生化學損傷。張瑾等[5]研究發現，氨基甲酸酯類農藥混合物對淡水生物青海弧菌Q67存在明顯的時間依賴毒性，且混合毒性與滅多威的濃度比呈良好的負相關關系。夏更壽[6]研究發現，丁硫克百威、殘殺威等6種氨基甲酸酯農藥均會對水華魚腥藻產生不同程度的毒性作用。這些研究說明，氨基甲酸酯類農藥對于水生生物具有潛在的風險，已引起人們的高度關注[7]，該類農藥污染物也成為GB5749—2006《生活飲用水衛生標準》中非常規指標的檢測項目之一[8]。因此，開展氨基甲酸酯類農藥對水生生物的安全性研究具有一定的實際環境意義。

藻類在生態系統中起著重要的作用[9]，藻類植物是水生生態系統的初級生產者，能通過光合作用為生物提供足夠的氧氣和食物，其種類多樣性和初級生產量直接影響水生生態系統的結構和功能，對生態系統的平衡和穩定起著重要作用。然而，環境中的污染物能顯著影響藻類的生長及分布[10]，如劉永濤等[11]發現漁用藥物強力霉素、甲苯咪唑和替米考星對斜生柵藻均具有一定毒性，具有良好的濃度-效應相關性。姜慧等[12]研究發現有機溶劑對蛋白核小球藻具有明顯的時間-濃度-毒性效應，陳敏等[13]研究發現抗生素與重金屬構成的復合污染物對綠藻也有明顯的時間-濃度-毒性效應。徐冬梅等[14]研究發現四環素類抗生素對蛋白核小球藻膜通透性、生長都會產生一定的影響。這些研究均顯示環境中的污染物對綠藻具有明顯的毒性效應，且綠藻對大部分污染物反應靈敏，同時還與暴露濃度和暴露時間明顯相關。

綜上所述，本研究擬以5種在素菜、食品和水體等中有殘留的氨基甲酸酯類農藥包括殘殺威(baygon, BAY)、滅多威(methomyl, MET)、抗蚜威(pirimicarb, PIR)、涕滅威(aldicarb, ALD)和呋喃丹(carbofuron, CAR)為研究對象，以蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa, C. pyrenoidosa)為受試生物，應用微板毒性分析法(MTA)[14]測定每種農藥及其混合物對蛋白核小球藻的生長抑制作用，同步探討其對蛋白核小球藻的葉綠素含量、蛋白質含量、超氧化物歧化酶活性(SOD)和脂質過氧化產物丙二醛(MDA)活性的影響，并應用濃度加和(CA)模型分析多元混合物間的毒性相互作用(加和作用、拮抗作用和協同作用)，進一步分析探討氨基甲酸酯類農藥及其混合物對蛋白核小球藻的毒性作用及可能的作用機理，為氨基甲酸酯類農藥環境安全性評價提供分析方法和數據參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與儀器

實驗用蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)購自中國科學院典型培養物保藏委員會淡水藻種庫(FACHB)，編號為FACHB-5，其培養方法參見文獻[14]。

5種農藥殘殺威(BAY)、滅多威(MET)、抗蚜威(PIR)、涕滅威(ALD)和呋喃丹(CAR)的純度均在99.0%以上，其分子結構、CAS號、分子量和儲備液濃度等列于表1中。

表1 5種農藥的分子結構、分子量、CAS號、儲備液濃度、擬合函數、參數(α、β、a、b、p、q)、部分統計量及半數效應濃度的負對數(pEC50)Table 1 The molecular structure, molecular weight, CAS number, stock concentration, fitted functions, parameters (α, β, a, b, p, q), some statistics and the negative logarithm of the half effect concentration (pEC50) of the five pesticides

注：W為Weibull擬合函數，L為Logit擬合函數，J為Biphasic擬合函數；r為相關系數，RMSE為均方根誤差；α和β是擬合函數參數；a和b是低濃度區域中值和斜率，p和q是高濃度區域中值和斜率。

Note: W, L and J are Weibull, Logit and Biphasic fitting function; r and RMSE are correlation coefficient and root-mean square error. α andβare parameters of fitting functions; a and b are the median and slope of the low concentration region; p and q are the median and slope of the high concentration region.

儀器：Synergy 2酶標儀(美國BioTek伯騰儀器有限公司)、SF-CT-1A超凈工作臺(三發儀器有限公司)、H1650-W醫用離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)、DH99-11DN細胞破碎儀(上海狄昊實業發展有限公司)、微量水生植物細胞破碎裝置(自制專利)、YXQ-LS-100A立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊醫療生物儀器股份有限公司)、MGC-250光照培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)、Dragon-lab單道可調移液器(10～100 μL，大龍興創實驗儀器有限公司)、PHYTO-PAM浮游植物分類熒光儀(澤泉科技有限公司)和TU—1950雙光束紫外可見分光光度計(北京析通用儀器有限責任公司)。

1.2 混合物設計

為了系統研究不同濃度配比的混合物組分間的聯合毒性相互作用，采用均勻設計射線法[15-16](uniform design ray, UD-Ray)，設計五元氨基甲酸酯類農藥混合體系，包括7條不同濃度配比(pi)的混合物射線R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7(表2)。

1.3 毒性測定

采用微板毒性分析法測定每種農藥對蛋白核小球藻在不同暴露時間的濃度-效應數據，其具體實驗方法和步驟參見文獻[17-18]。

1.4 濃度-效應曲線(CRC)擬合

為了得到單個化合物及其混合物的效應值和效應濃度，尤其是低效應濃度，對MTA法測定的濃度-效應數據進行非線性最小二乘法擬合。一般地，對于呈現經典“S”型特征，采用Logit和Weibull函數擬合[19]，而呈“J”型特征的采用Biphasic函數擬合[20]。非線性函數Logit、Weibull和Biphasic公式如下：

(1)

Logit E=1/(1+exp (-α-β×log10(c)))

(2)

Weibull E=1-exp (exp (α+β×log10(c)))

(3)

式中：E表示效應(0≤E≤1)，c表示單個化合物或者混合物濃度，α和β是參數。a和b是低濃度區域的中值和斜率，p和q是高濃度區域的中值和斜率，m是底部，C是測試化學品的濃度。

無論毒性試驗如何精確以及描述函數選擇如何準確，固有的實驗誤差與函數擬合誤差均客觀存在，在描述擬合函數不確定度的同時也考慮實驗誤差的置信區間，即觀測置信區間(OCI)，常被用于表征毒性實驗數據的精密程度。

1.5 混合物毒性相互作用

目前常用CA模型評估混合物毒性作用類型[21]。本研究中應用CA預測各個混合物在相應百分濃度下的混合物毒性并與實驗觀測毒性進行比較，進而分析各濃度比混合物的毒性作用規律。如果混合物的實驗觀測毒性偏離CA參考模型預測值則認為該混合物具有毒性相互作用[22]。CA模型的公式表達為：

(4)

或

(5)

式中：ci表示混合物中產生某一效應x%時組分i的濃度，ECx，i表示混合物中第i個化合物單獨存在時所產生的效應與混合物總效應x%相同時的濃度，pi表示組分i的濃度分數或者濃度比。

1.6 蛋白核小球藻中葉綠素含量的測定

采用葉綠素熒光儀測定蛋白核小球藻的葉綠素含量。依據時間-濃度-效應曲線，計算每種農藥對綠藻的半數效應濃度(EC50)。取適量5種農藥儲備液于到同等體積的藻液中，使每種農藥的濃度為EC50，放入培養箱，其溫度、時間與毒性測定溫度、時間相同，在不同暴露時間點(24、48、72、96 h)取待測藻液，測其葉綠素含量。

表2 五元混合物體系組分及其濃度配比(pi)Table 2 The concentration ratios (pi) of each substance in five-component mixture system

1.7 蛋白核小球藻中蛋白質濃度的測定

研發者在UNWin軟件中增加了DNA/蛋白質測定功能。直接測定蛋白核小球藻的蛋白質含量，在不同暴露時間點(24、48、72、96 h)取待測藻液，置于石英比色皿中，測定蛋白核小球藻的蛋白質濃度。

1.8 蛋白核小球藻中超氧化物歧化酶(SOD)活性和脂質過氧化產物丙二醛(MDA)含量的測定

分別在暴露時間為24、48、72和96 h時，將5種待測藻液分別取2 mL于離心管中，4 ℃水浴條件下超聲破碎15 min，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液測SOD活性和MDA含量。SOD酶活性測定采用羥胺法測試盒(貨號：A001-1)，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法測試盒(貨號：A003-1)。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 單一農藥對蛋白核小球藻的不同暴露時間-濃度-效應關系

5種氨基甲酸酯農藥對蛋白核小球藻的時間-濃度-效應數據的擬合函數、擬合參數值以及統計分析結果(r2和RMSE)見表1。

從表1看出Logit、Weibull和Biphasic函數對暴露72～96 h的濃度-效應數據擬合結果較好(r>0.9, RMSE<0.1)。對于12、24、48 h的數據擬合較差，可能是由于C. pyrenoidosa的生長還處于適應農藥存在的階段，或者需要采用其他更適合的函數擬合。這5種農藥的EC50值的范圍跨越3個數量級，在不同暴露時間內均為低毒(pEC50<3.5)。不同農藥對C. pyrenoidosa的毒性大小不同，且隨著暴露時間延長，毒性大小也發生改變。以96 h-pEC50為毒性指標[23-24]，5種農藥毒性大小為：呋喃丹(pEC50=3.43)>殘殺威(pEC50=2.76)>抗蚜威(pEC50=2.12)>滅多威(pEC50=2.11)>涕滅威(pEC50=1.89)。

以時間為x軸，濃度為y軸，抑制率為z軸構建5種農藥的時間-濃度-效應圖，如圖1所示，殘殺威、呋喃丹、滅多威和涕滅威對C. pyrenoidosa的毒性-效應為抑制作用，且隨著時間和濃度的增大而增大，呈現經典S形。除呋喃丹，其他3種農藥在12 h時幾乎無毒性變化，但4種農藥的毒性都是隨暴露時間延長，毒性逐漸增加，抑制率可達到50%以上。抗蚜威在中低濃度區間對C. pyrenoidosa產生刺激作用，隨暴露時間延長刺激作用不斷增大，高濃度產生抑制作用，呈現非單調J形濃度-效應特征。

2.2 5種農藥對蛋白核小球藻的生理影響

2.2.1 5種農藥對蛋白核小球藻中葉綠素含量的影響

植物的光合作用離不開葉綠素，同時葉綠素含量高低能夠表征藻細胞的存活狀況和生物量的多少[25]。5種氨基甲酸酯類農藥在不同時間(24、48、72和96 h)對蛋白核小球藻中葉綠素含量的影響見圖2。

從圖2可見，5種農藥處理的小球藻葉綠素與空白藻液葉綠素含量比較，隨暴露時間延長均有減少。但不同農藥處理后的藻液中葉綠素變化的規律不同。滅多威的作用下，隨著暴露時間的延長，葉綠素減少率不斷變小，可能是蛋白核小球藻產生了耐藥性。對于其他4種農藥，隨著暴露時間的延長，葉綠素減少率均不斷增大。在96 h時，5種農藥處理下，小球藻葉綠素的減少率分別為：呋喃丹(37%)、殘殺威(52%)、抗蚜威(44%)、涕滅威(49%)和滅多威(44%)。葉綠素的抑制率在可控誤差范圍內都接近50%，葉綠素的抑制率與生長抑制率(毒性效應終點)基本相似，可見毒性效應在EC50時大致是受到葉綠素的變化影響。

在不同時間(24、48、72和96 h)時，5種農藥處理的小球藻與對照組小球藻相比較，涕滅威、抗蚜威和呋喃丹呈現顯著(n=4, P<0.01)統計學差異；殘殺威和滅多威呈現顯著(n=4, P<0.05)統計學差異，葉綠素含量變化具有時間效應。

2.2.2 5種農藥對蛋白核小球藻中蛋白質含量的影響

蛋白質在植物體內承擔著重要的功能，蛋白質的含量是細胞活性、生命能力和生活狀態的重要指標。5種氨基甲酸酯類農藥在不同時間(24、48、72和96 h)對蛋白核小球藻中蛋白質含量影響見圖3。

由圖3可見，空白組蛋白質含量隨暴露時間的延長而增加，所有實驗組蛋白質含量均表現隨暴露時間的延長而減少。空白組與實驗組相比較，存在著實驗組高于空白組，表現出刺激作用。呋喃丹、滅多威和涕滅威在24 h時，表現刺激作用，在藻細胞對數生長初期(24 h)，蛋白質含量增加，分別為呋喃丹(-29%)、滅多威(-0%)和涕滅威(-24%)，表現出超補償作用[26]。抗蚜威和殘殺威在整個暴露時間范圍內實驗組均低于空白對照組，蛋白質含量不斷減少。在96 h時5種農藥處理下，小球藻蛋白質的減少率分別為：呋喃丹(42%)>殘殺威(39%)>抗蚜威(34%)>滅多威(30%)>涕滅威(22%)，其蛋白質減少率排序與生長抑制率(毒性效應終點)排序一致。在72～96 h暴露時間內，空白對照組蛋白質含量與實驗組蛋白質含量相比較，5種農藥均具有顯著性的統計學差異(n=2, P<0.01)，可見蛋白質含量在較長的暴露時間段具有時間效應。

2.2.3 5種農藥對蛋白核小球藻中SOD酶活性和MDA含量影響

實驗中，我們發現農藥處理后的藻液中有無色沉淀，經分析，可能是因為葉綠素和蛋白質的生物合成需要通過一系列的酶促反應，在本實驗中綠藻的酶因失去活性而沉淀下來。因此，本實驗又進一步分析了酶活性及含量的變化情況。5種氨基甲酸酯類農藥和空白樣對藻細胞的SOD酶活性和MDA含量的影響見圖4。

從圖4的SOD活性效應圖可看出：涕滅威在24～48 h時SOD活力升高，有效的消除了細胞內自由基的損傷，使細胞代謝緩慢恢復正常。48 h之后的暴露時間，細胞結構損害程度增大，導致酶蛋白的結構受到損害，最終導致其細胞內的SOD含量降低。其他4種農藥對藻細胞內的SOD酶活性影響，均隨暴露時間的延長而降低，呋喃丹對藻細胞內的SOD活力影響最明顯，在暴露時間內不斷降低，其他3種農藥隨暴露時延長SOD活力下降趨勢趨于平緩。實驗組SOD活性和對照組SOD活性相比較；抗蚜威、殘殺威和滅多威在暴露時間24～96 h時均具有顯著的統計學差異(n=4, P<0.05)，呈現時間-效應關系。涕滅威在48～96 h時具有顯著的統計學差異(n =3, P <0.05)呈現時間-效應關系。短時間內無顯著差異。呋喃丹在72～96 h內具有顯著的統計學差異(n =2, P <0.01)，呈現時間-效應關系。

圖3 5種農藥在不同時間對蛋白核小球藻蛋白質含量的影響Fig. 3 Effects of five pesticides on the protein content of Chlorella pyrenoidsa at different times

圖4 5種農藥在不同時間對蛋白核小球藻超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的影響Fig. 4 Effects of five pesticides on superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content of Chlorella pyrenoidsa at different times

此外，從MDA效應圖可以看出，空白藻細胞內的MDA含量隨暴露時間的延長緩慢上升。5種農藥處理過的藻細胞內的MDA含量隨暴露時間的延長均不斷上升。側面反映出氨基甲酸酯類農藥對藻細胞內的SOD活性的抑制作用，導致細胞內的膜脂過氧化而產生了毒害的作用[27]。總而言之，藻細的抗氧化能力降低，體內的H2O2積累，藻細胞MDA含量上升，最終導致毒害作用。

2.3 農藥五元混合物對蛋白核小球藻的聯合毒性作用

2.3.1 農藥五元混合物對蛋白小球藻的毒性效應

五元混合物7條射線對蛋白核小球藻的毒性也具有明顯的時間依賴性(表2)，其濃度-效應曲線表現出與抗蚜威類似的變化規律，其96 h的濃度-效應曲線見圖5。

圖5 7條混合物射線在96 h的濃度-效應曲線Fig. 5 Concentration-effect curves of 7 mixture rays at 96 h

從圖5可以看出，五元混合物7條射線的96 h濃度-效應曲線呈現“J”型，即低濃度區域毒性作用為刺激作用，高濃度區域產生抑制作用，不同濃度配比射線的毒性-效應存在明顯差異，最大刺激作用也不同。結合表2和圖5還可以看出，抗蚜威的濃度配比最大，導致五元混合物在低濃度區域產生刺激作用，但是不排除其他物質相互作用也會產生同樣的刺激作用，同時也說明多元混合物聯合毒性作用的復雜性。

結合表2，我們進一步分析發現，五元混合物的毒性pEC50值與其組分濃度比(pi)具有良好的線性關系(圖6)。從圖6可以看出，五元混合物的7條射線pEC50與殘殺威、滅多威、涕滅威和呋喃丹的組分濃度比(pi)之間有著顯著正線性關系，相關系數為0.944、0.811、0.885和0.957，顯著性水平為0.001、0.027、0.008和0.001。與抗蚜威的組分濃度比(pi)之間有著顯著負線性關系，相關系數為-0.921，顯著性水平為0.003。張瑾等[5]研究發現，氨基甲酸酯類農藥混合物對淡水生物青海弧菌Q67存在明顯的時間依賴毒性，但混合毒性與滅多威的濃度比呈良好的負相關關系，這可能是由于農藥對不同生物的毒性作用機理不同。

2.3.2 農藥五元混合物對蛋白核小球藻的毒性相互作用

基于CA模型對五元混合物的毒性作用進行評估，混合物對蛋白核小球藻的毒性大部分呈加和作用，少數混合物的CA預測線偏離了混合物毒性的觀測值，如圖7所示。從圖7可以看出，在較高濃度區域，7條射線均呈現出了拮抗作用，但不同的射線，拮抗作用程度不同。在較低濃度區域，7條混合物射線的CA預測線也與觀測毒性發生了偏離，但由于CRC曲線呈J形(即刺激作用)，在此濃度區域，可能是混合物的刺激作用使CA預測發生了偏離，但也有可能存在拮抗作用與刺激作用同時發生的復雜情況。對于R6射線，從72 h到96 h，CA預測線偏離觀測濃度越來越明顯，體現了時間依賴性。結合混合物射線毒性與組分濃度比的相關性，可推斷出多元混合物對受試生物的毒性作用，受組分、組分濃度配比和濃度區域等因素的影響。

2.4 5種農藥混合物對蛋白核小球藻生理特性的影響

2.4.1 5種農藥混合物對蛋白核小球藻中葉綠素含量的影響

選擇了五元混合物中具有最大刺激效應的射線R5，測其最大刺激濃度在不同暴露時間(24、48、72和96 h)對蛋白核小球藻葉綠素含量的影響，結果見圖8。從圖8中可看到，隨暴露時間的延長，實驗組葉綠素含量均高于空白對照組葉綠素含量。暴露時間在24～48 h時，實驗組葉綠素含量增加緩慢，暴露時間在48～96 h時，混合物充分作用于蛋白核小球藻，導致葉綠素含量快速增加，最終葉綠素含量增加近22%。在可控誤差范圍內葉綠素增加率值與混合物射線R5在96 h時的刺激效應大致接近，可見五元混合物是刺激了葉綠素含量增加從而導致了毒性效應為刺激效應；在不同暴露時間(24、48、72和96 h)實驗組小球藻葉綠素含量與對照組小球藻葉綠素含量相比較，在48～96 h時，具有顯著的統計學差異(n=3, P<0.05)，呈現時間-效應關系。

圖6 五元混合物組分濃度比(pi)與混合物7條射線pEC50線性關系圖Fig. 6 The relationship between the concentration ratio of each substance (pi) and the pEC50 value of 7 rays in five-component mixture system

圖7 五元混合物在不同暴露時間對蛋白核小球藻的毒性相互作用Fig. 7 Toxicity interaction of five pesticides on Chlorella pyrenoidsa at different times in five-component mixture system

圖8 五元混合物對蛋白核小球藻中葉綠素含量的影響Fig. 8 Effects of five-pesticide mixture on chlorophyll content in Chlorella pyrenoidosa

2.4.2 農藥五元混合物對蛋白核小球藻中蛋白質含量的影響

五元混合物最大刺激濃度和空白樣在不同暴露時間(24、48、72和96 h)對蛋白核小球藻蛋白質含量的影響結果見圖9。

圖9 五元混合物對蛋白核小球藻中蛋白質含量的影響Fig. 9 Effects of five-pesticide mixture on protein content in Chlorella pyrenoidosa

從圖9可看出，隨著暴露時間的不斷延長，實驗組蛋白質含量和對照組蛋白質含量均不斷增加，且實驗組蛋白質含量在各個暴露時間均高于對照組蛋白質含量，表現出刺激生長作用。在細胞生長初期，刺激作用不明顯，隨著暴露時間的不斷延長，刺激作用增大，蛋白質含量顯著增多，增長率達到25%。在暴露時間24～96 h內，實驗組蛋白質含量與對照組蛋白質含量相比較，均呈現顯著的統計學差異(n=4, P<0.01)，呈現時間-效應關系。

2.4.3 農藥五元混合物對蛋白核小球藻中SOD活性和MDA含量的影響

五元混合物最大刺激濃度(混合物射線R5)和空白樣在不同暴露時間(24、48、72和96 h)對蛋白核小球藻SOD活性和MDA含量的影響結果見圖10。

從圖10可以看出，隨著暴露時間的延長，空白樣藻細胞內的SOD酶活性下降趨勢較低，幾乎不變，MDA含量稍有增加，此過程為藻細胞正常代謝過程。實驗組的藻細胞由于農藥混合物的刺激影響，導致SOD活性隨暴露時間延長不斷增加，且暴露時間越長增加越快。MDA含量隨著暴露時間的延長不斷降低；在24～96 h暴露時間內，實驗組藻細胞SOD活性和空白樣藻細胞SOD活性相比較，具有顯著的統計學差異(n=4, P<0.05)，呈現時間-效應關系。

圖10 五元混合物對蛋白核小球藻中SOD活性和MDA含量的影響Fig. 10 Effects of five pesticide mixture on SOD activity and MDA content in Chlorella pyrenoidosa

綜上所述：(1)氨基甲酸酯類農藥對蛋白核小球藻毒性均有明顯的時間依賴性濃度-效應關系，抗蚜威的CRC呈現J形，其余4種呈S形；不同的農藥在同一暴露時間的毒性不同，毒性大小順序隨著時間延長而改變，在96 h的毒性大小順序為呋喃丹>殘殺威>抗蚜威>滅多威>涕滅威。

(2)氨基甲酸酯類農藥在較高濃度(如EC50)時，明顯降低蛋白核小球中的葉綠素、蛋白質含量以及SOD酶活性，但MDA含量增加，均具有明顯的時間依賴性，可能是由于隨著暴露時間延長，藻細胞受到破壞，葉綠素也隨之遭到破壞，蛋白質含量下降，脂質過氧化的損害大于細胞自身修復能力，導致SOD活性被抑制，細胞的抗氧化能力下降，藻細胞內的H2O2不斷積累，導致MDA含量升高。隨暴露時間的延長，藻細胞SOD活性變化具有時間-效應關系。

(3)五元混合物體系的毒性具有時間依賴性，7條射線在96 h呈現“低促高抑”現象，且隨著濃度配比的不同呈現顯著差異。7條射線pEC50與滅多威、殘殺威、涕滅威和呋喃丹的組分濃度比(pi)之間有著顯著正線性關系，與抗蚜威的組分濃度比(pi)之間有著顯著負線性關系；混合物間的拮抗作用不僅與時間有關，還與濃度區域和組分濃度配比(pi)存在明顯的關系，這說明抗蚜威的負相關性可能是導致混合物低濃度刺激和高濃度拮抗作用產生的重要因素之一。

(4)五元農藥混合物中最大刺激濃度(R5射線)對蛋白核小球藻葉綠素和蛋白質含量以及酶活性均隨暴露時間延長逐漸增加，而MDA含量逐漸降低，呈現出與生長抑制毒性一致的變化規律。