鹵代肉桂酸對羊角月牙藻的急性毒性及3D-QSAR研究

李敏，殷茂嬌，朱娟娟，馬海軍,*

1. 北方民族大學生物科學與工程學院，銀川 750021 2. 寧夏葡萄與葡萄酒技術創新中心，銀川 750021

鹵代芳烴類化合物由于富含C—F、C—Cl和C—Br等高能化學鍵及一至數個芳香環，分子結構穩定，在土壤、水體等介質中很難依靠自然自凈過程降解去除；近年來該類化合物在環境中廣泛分布、持久存在，并具有潛在的生物毒性風險，因此引起了巨大關注[1-2]。鹵代肉桂酸是一類鹵代芳烴類化合物，廣泛應用于電子、醫藥、化妝品和除草劑等的生產。隨著使用量的增加，其進入環境所帶來的潛在生態環境健康風險不容忽視。但是，目前環境科學領域對鹵代肉桂酸類化合物的環境效應，包括環境殘留水平、環境遷移轉化行為、生態毒理效應和生物降解性能等相關研究十分匱乏，亟待填補[3-6]。

由于污染物種類繁多，對每一個化合物采用實驗手段進行毒性測試是難以實現的。定量結構-活性相關研究(quantitative structure-activity relationship, QSAR)為此類問題的解決提供了一個有效途徑，其旨在對部分有機化合物的生物毒性數據與結構參數進行統計建模，進而預測其他結構類似化合物的生物毒性；研究結果可為環境中有機污染物的風險評價、揭示致毒機制等提供理論參考[7-8]，是當今藥物化學、環境化學及計算機化學等領域的一個前沿課題[9-10]。

羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)是淡水水體中的常見藻類，對污染脅迫十分敏感，常作為經典水生毒理學受試生物應用于污染物和化學品的毒理研究[11]。因此，本文考察常見14種鹵代肉桂酸化合物對羊角月牙藻的生長抑制作用，并利用3D-QSAR中比較分子場分析法(comparative molecular field analysis, CoMFA)和比較分子相似性指數法(comparative molecular similarity index analysis, CoMSIA)，揭示該類化合物分子結構與其毒性效應之間的內在關系，為鹵代肉桂酸類化合物生態環境健康風險評估提供基礎數據支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

羊角月牙藻購自中國科學院武漢水生生物研究所淡水藻種庫，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、14種鹵代肉桂酸類化合物(種類見表1)購自阿拉丁試劑(中國，上海)。實驗所用試劑均為分析純。

1.2 藻種培養及急性毒性測試

藻種培養基選擇BG11(Blue-Green Medium)人工培養液。羊角月牙藻藻種轉到BG11人工培養液后，放入溫度為(25±1) ℃、光暗比為12 h∶12 h、光強為2 000 lux、轉速為150 r·min-1的立式光照搖床培養箱中擴大培養，隔96 h移種一次，反復3～5次，使藻類達到同步生長階段，以此作為實驗藻種。

準確稱取鹵代肉桂酸化合物100 mg(0.10 g，稱量范圍0.095～0.105 g)，用DMSO溶解并定容至10 mL容量瓶，獲得10 mg·mL-1高濃度母液。取少量對數生長期的藻種用培養基稀釋后，獲得初始藻液密度約為104個·mL-1的試驗藻液。取試驗藻液50 mL于250 mL錐形瓶中，分別加入一定體積10 mg·mL-1鹵代肉桂酸高濃度母液，每個化合物在0～100 mg·L-1濃度范圍內按一定間隔獲得5～7個濃度梯度；同時設立DMSO溶劑對照組，每個處理3個平行。培養條件與藻種的擴大培養條件一致。采用顯微鏡下血球計數板計數方法建立羊角月牙藻細胞密度(個·mL-1)與藻液光密度OD680之間的相關關系。分別于0、24、48和72 h測定各樣品OD680值，換算成藻液細胞密度后，根據公式(1)計算抑制率[12-13]。

抑制率(%) = (1-N/N0)×100%

(1)

式中：N為樣品處理組細胞數，N0為空白對照細胞數。

在獲得不同濃度鹵代肉桂酸對藻生長抑制率的基礎上，采用概率單位回歸法計算各化合物對羊角月牙藻的72 h-EC50值。

1.3 三維定量構效關系建模

定量構效關系建模分析中，生物活性數值采用以摩爾濃度單位計的EC50(μmol·L-1)數值，具體見表1。利用CoMFA和CoMSIA方法進行3D-QSAR分析，所有操作均采用SYBYL7.0軟件各模塊完成?；衔锓肿咏Y構優化使用Tripos力場，分子電荷采用Gasteiger-Huckel電荷，能量最小化計算過程中，將Max.Iterations增加到1 000，Gradient減低為0.005，Color Option設為Force。采用4-氯肉桂酸為模板，使用Align Database方法將所有分子進行疊合。其疊合效果如圖1所示。統計學分析采用偏最小二乘(partial least squares analysis, PLS)方法建立模型，采用去一法(leave-one-out, LOO)進行交叉驗證。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 鹵代肉桂酸對羊角月牙藻毒性的劑量效應

14種鹵代肉桂酸類化合物對羊角月牙藻的生長毒性作用測定結果如表1所示，結果顯示，在0～100 mg·L-1濃度范圍內上述化合物均對羊角月牙藻產生明顯的毒性效應，且濃度越大，毒性越強。其中，4-氯、4-溴肉桂酸對羊角月牙藻的毒性最強，其72 h-EC50值分別為45.88和49.79 mg·L-1，2,4-二氟肉桂酸對羊角月牙藻的毒性最弱。

本次研究囊括的化合物，以肉桂酸為母核結構，苯環上不同取代位點和不同取代基類型(鹵素原子種類)構成了分子結構的多樣性，各化合物對羊角月牙藻的生長抑制效應也表現出一定差異。因此，采用CoMFA及CoMSIA方法對鹵代肉桂酸抑制羊角月牙藻生長的毒性效應與分子結構之間的內在關聯進行系統科學的分析。

2.2 鹵代肉桂酸對羊角月牙藻毒性的定量構效關系

2.2.1 CoMFA及CoMSIA建模統計學分析

經多次嘗試，構建最優的CoMFA模型統計學參數如表2所示。CoMFA模型的交叉驗證相關系數Q2為0.804，最佳主成分數為3，表明獲得的模型具有良好的自身一致性；在95%置信度水平進行非交互驗證，得到模型的相關系數R2為0.942，標準偏差SEE為18.54，F值為54.54，以上參數表明所建模型具有良好的擬合能力和預測能力[14]，模型對14種化合物的實驗值和預測值的關系見圖2(a)，線性擬合相關系數為0.9692。立體場與靜電場的貢獻值分別為63.3%和36.7%，說明鹵代肉桂酸化合物分子立體場和靜電場特性均對毒性大小產生影響，其中立體場貢獻更大。

考慮到分子的立體特性與其疏水特性聯系密切，且鹵代肉桂酸化合物結構中存在羥基、羧基等多種氫鍵供體和受體官能團，分子氫鍵供體和受體特性對生物毒性效應的影響值得探究。因此，本研究進一步采用CoMSIA方法進行定量構效關系建模分析。獲得的CoMSIA Ⅰ及CoMSIA Ⅱ模型統計學參數如表2所示。

CoMSIA Ⅰ模型的交叉驗證相關系數Q2為0.668，最佳主成分數為5；非交互驗證得到模型的相關系數R2為0.969，標準偏差SEE為15.25，F值為49.74，靜電場、疏水場、立體場、氫鍵供體及受體場均有貢獻，其中前兩者起主要作用；計算發現，若僅考慮靜電場和疏水場，建立的CoMSIA Ⅱ模型Q2和F值略有下降，分別為0.655和30.07，但R2提高至0.990，靜電場與疏水場的貢獻值分別為62.2%和37.8%，CoMSIA Ⅱ模型實驗值和預測值的關系見圖2(b)，線性擬合相關系數為0.9685。

2.2.2 CoMFA及CoMSIA三維等高圖分析

CoMFA模型三維等高圖如圖3所示，其非常直觀地顯示出分子結構立體性質和靜電性質對毒性大小的影響。其中，在立體場中，綠色表示增大基團體積會導致毒性增強，黃色表示減小基團體積會導致毒性增強；在靜電場中，紅色表示增加帶負電基團會導致毒性增強，藍色表示增加帶正電基團會導致毒性增強。

在CoMFA模型的立體場中，苯環上3、4號位點附近出現大面積的綠色色塊，代表在上述位置存在大體積取代基會增強鹵代肉桂酸化合物對羊角月牙藻的毒性效應。對比3-氯肉桂酸和3-溴肉桂酸72 h-EC50值發現，隨著3位取代鹵素原子體積的增加，其對羊角月牙藻的毒性作用增強。4-氟、4-氯和4-溴肉桂酸3種化合物對羊角月牙藻的毒性效應，同樣隨著鹵素原子半徑的增大而增強；此外，2-氟肉桂酸與4-溴-2-氟肉桂酸、4-氟肉桂酸與4-三氟甲基肉桂酸，這2組化合物均表現出隨著4位取代基體積增大，毒性作用增強的趨勢。上述實驗結果與CoMFA立體場等勢圖顯示的結果完全一致。

在CoMFA模型的靜電場中，苯環母核上覆蓋了大面積的藍色色塊，代表苯環上取代基電負性越小，化合物對羊角月牙藻的毒性越大。鹵素原子電負性排序為F>Cl>Br，4-氟、4-氯和4-溴肉桂酸3種化合物毒性作用隨著鹵素原子電負性降低而增強；2-氟與2-氯肉桂酸、3-氯與3-溴肉桂酸2組化合物同樣符合上述規律。

CoMSIAⅡ模型三維等高圖如圖4所示。圖4(a)與圖3(b)結果相比，重點強調苯環2、3號位點取代基電負性越小，化合物毒性效應越強。CoMSIA Ⅱ模型疏水場如圖4(b)所示。在疏水場中，黃色表示增加疏水性基團導致毒性增大，白色表示增加親水性基團導致毒性增大。苯環母核3、4和6號位點附近覆蓋了大面積的黃色色塊，表明在上述位點增加疏水性取代基會導致鹵代肉桂酸毒性增強。鹵素是常見的憎水基團，實驗數據表明，在肉桂酸分子中引入鹵素，尤其是氯或者溴，將增加化合物對羊角月牙藻的毒性。

表1 鹵代肉桂酸對羊角月牙藻毒性的實驗值與模型分析值Table 1 The experimental and model-predicted values of halogenated cinnamic acids on the growth of Selenastrum capricornutum

注： CoMFA表示比較分子場分析法，CoMSIA表示比較分子相似性指數法。

Note: CoMFA stands for comparative molecular field analysis; CoMSIA stands for comparative molecular similarity index analysis; Exp. stands for experimental values; Pred. stands for predicted values; Res. stands for residual values.

圖1 14種鹵代肉桂酸類化合物分子疊合圖Fig. 1 Molecular overlap diagram of 14 halogenated cinnamic acids

3 討論(Discussion)

鹵代苯酚、鹵代苯甲酸等化合物與鹵代肉桂酸在結構上具有一定類似性，已有研究發現，苯甲酸和單鹵代苯甲酸對羊角月牙藻的48-h EC50分別為83.29、13.48～83.11mg·L-1，即在苯環結構上增加鹵素原子取代基，將導致該類化合物對羊角月牙藻的毒性增強[15]；苯酚、一氯代苯酚和多氯代苯酚對羊角月牙藻的72 h-EC50分別為197、11.5～51.8和2.10～16.1 mg·L-1，表明隨著苯環上氯原子數量的增多，該類化合物的毒性效應呈較顯著的增加趨勢[16]。本研究結果顯示，肉桂酸和鹵代肉桂酸對羊角月牙藻的72 h-EC50分別為55.70、45.88～83.72 mg·L-1，毒性大小與類似污染物基本處在同一水平，但苯環上增加鹵素原子取代基后并未導致毒性顯著增強。參照國標藻類生長抑制試驗中農藥對藻類毒性等級劃分標準[17]，鹵代肉桂酸類化合物對羊角月牙藻的毒性屬于低毒范圍(72 h-EC50>3.0 mg·L-1)。目前，還沒有相關文獻報道鹵代肉桂酸類化合物在自然環境中的分布情況及殘留水平，但從其對羊角月牙藻的低毒性效應來看，其對水環境中浮游藻類生長的危害較小。但是該結論僅限于72 h的實驗結果，其長期毒性試驗、其他毒性效應及風險評估還需進一步研究和完善。

圖2 生物毒性預測值與實驗值關系圖Fig. 2 The relation schema of biological toxicity between predicted values and experimental values

圖3 CoMFA模型三維等勢圖Fig. 3 Contour maps of CoMFA model

圖4 CoMSIA Ⅱ模型三維等勢圖Fig. 4 Contour maps of CoMSIA Ⅱ model

表2 模型的偏最小二乘法分析結果Table 2 Partial least squares (PLS) results of the models in this study

本研究采用3D-QSAR方法定量分析鹵代肉桂酸對羊角月牙藻的毒性效應，獲得CoMFA模型Q2=0.804，R2=0.942；CoMSIA Ⅱ模型的Q2=0.655，R2=0.990。其中，分子結構中靜電場、立體場和疏水場對毒性效應的影響較大。利用CoMFA和CoMSIA模型的等高圖可以在一定程度上探討化合物的致毒機制[18-19]。分子水平的致毒作用機制一般分為特異型和非特異型兩大類；其中，特異型指化合物分子結構中存在反應性的取代基團，容易同酶、蛋白質等生物受體分子發生生物化學反應；而非特異型機制指結構類似的分子能夠產生性質類似的生物反應，且反應過程對特殊化學結構的依賴較弱，主要控制因素為化學分子在生物體和水相的分配比例，即分子的疏水性[20-23]。一般而言，分子的疏水性與立體場存在較大聯系。本研究CoMFA與CoMSIA Ⅱ模型中，立體場和疏水場貢獻率分別占比63.3%和37.8%，提示鹵代肉桂酸類化合物致毒作用中非特異型反應占較大比重。眾多有機化合物對羊角月牙藻急性毒性的QSAR研究表明，分子的疏水特性是表征化合物毒性大小的重要參數[24-25]，本研究結果與之一致。本研究也嘗試應用CoMSIA方法將分子的氫鍵供體和受體性質納入考察范圍，發現上述2種參數對構效關系貢獻值非常小，進一步提示非特異型反應占比較大。然而，不論是CoMFA還是CoMSIA Ⅱ模型，靜電場均有較大貢獻，分別占比36.7%和62.2%，據此推測在暴露過程中藻體與鹵代肉桂酸分子之間可能存在電子轉移。此外，鹵代肉桂酸類化合物苯環1號位上具有共同的取代基丙烯酸，其對化合物毒性的作用不容忽視；由于本研究考察的14種化合物在苯環1號位上無差別，因此丙烯酸基的作用無法探究，有待進一步揭示。

綜上所述，通過對14種鹵代肉桂酸類化合物的羊角月牙藻急性毒性檢測和定量構效關系研究，發現該類化合物具有一定的急性毒性效應，72 h-EC50值在幾十mg·L-1水平，其若長期排放或大量殘留則可能導致一定生態環境風險。將該類化合物對羊角月牙藻的毒性值分別與CoMFA和CoMSIA值進行PLS分析，獲得了穩健可靠的3D-QSAR模型；定量構效關系表明分子結構立體場、疏水場和靜電場性質對毒性效應影響顯著，在分子苯環結構上引入體積較大、電負性較小及疏水性較強的取代基，將導致毒性升高。

致謝：感謝中國科學院生態環境研究中心杜宇國和魏東斌研究員研究團隊給予SYBYL軟件平臺的支持和在建模過程中的指導幫助！