取代苯酚類化合物抑藻活性的CoMFA模型

唐自強(qiáng),馮長君

1. 徐州工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，徐州 221018 2. 徐州技師學(xué)院，徐州 221151

取代苯酚類化合物是有機(jī)工業(yè)中重要的一類物質(zhì)，但大多都有毒性。其中鄰氯苯酚等4種酚類化合物被美國環(huán)境保護(hù)局列為優(yōu)先控制的有機(jī)污染物，7種取代苯酚化合物被確定為中國優(yōu)先控制的有機(jī)污染物[1]。因此，取代苯酚類化合物的生物毒性預(yù)測引起人們的關(guān)注。研究表明，定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(quantitative structure-activity relationship, QSAR)[2-11]在預(yù)測化合物生物毒性方面已成為化學(xué)、環(huán)境等學(xué)科的一個重要領(lǐng)域。徐文國等[12]采用量化方法研究氯代苯酚類化合物對發(fā)光菌毒性；劉夠生等[13]采用量化及連接性指數(shù)方法研究氯代苯酚類化合物對發(fā)光菌毒性；羅一帆和許旋[14]以量化方法研究氯代苯酚類化合物對魚類毒性；廖立敏等[15]以新的結(jié)構(gòu)描述符關(guān)聯(lián)氯代苯酚類化合物對海洋中的杜氏鹽藻(Dunaliella salina)的抑制活性；Serge等[16]以量化方法研究了有機(jī)化學(xué)品對綠藻的生物毒性。上述研究都取得良好結(jié)果，但都局限于2D-QSAR研究。本文以3D-QSAR方法[17-20]研究氯代苯酚類化合物對海洋中的杜氏鹽藻的抑制活性(pI)[15]，以揭示影響抑制活性的微觀結(jié)構(gòu)因素，探討其發(fā)揮生物毒性作用的分子機(jī)理。

1 數(shù)據(jù)來源(Data source)

20個氯代苯酚類化合物對海洋中的杜氏鹽藻(96 h)的半數(shù)抑制濃度以“IC50”表示。考慮化學(xué)平衡常數(shù)與平衡濃度為對數(shù)關(guān)系，故令：

pI =-lg(IC50)

(1)

pI值來源于文獻(xiàn)[15]。氯代苯酚類分子的具體結(jié)構(gòu)及pI數(shù)據(jù)見表1。

2 建模方法(Modeling method)

本文3D-QSAR分析及建立CoMFA模型均使用Tripos公司最新版本Sybylx2.1.1分子模擬軟件完成，使用的模塊包括SYBYL、Sketch、Minimize、Database-alignment以及CoMFA的QSAR方法等，各項參數(shù)除特別指明外均采用缺省值。

表1 氯代苯酚類分子的結(jié)構(gòu)與抑藻活性(pI)Table 1 The structures and inhibitory effect on algae activity (pI) of chlorinated phenolic compounds

注：*表示測試集。

Note: * indicates test set.

2.1 化合物低能構(gòu)象的確定及分子疊合

分子活性構(gòu)象的確定是建立有效3D-QSAR模型的首要前提之一。通常采用分子的最低能量構(gòu)象代替藥效活性構(gòu)象。使用Sybylx2.1.1軟件中的Sketch molecule模塊先構(gòu)建20個氯代苯酚類分子的初始三維結(jié)構(gòu)，再通過Minimize模塊，選取Tripos力場，加Gasteiger-Huckel電荷，將最大迭代次數(shù)(Max. Iterations)定為1 000，將Gradient降低到0.005；最后將Powell能量梯度法的收斂梯度設(shè)為0.21 kJ·mol-1·nm-1。以此完成所有氯代苯酚類分子的分子力學(xué)優(yōu)化，并以此最低能量構(gòu)象作為分子疊合的生物活性構(gòu)象。

隨機(jī)選取分子6、9、13、19和20為測試集(Test set)，其中20號為模板分子，為表1中帶“*”的分子；余下16個分子作為訓(xùn)練集(Training set)，亦含20號模板分子。在CoMFA研究中，所謂模板分子是指總體上生物活性最強(qiáng)的分子。常用的是基于公共骨架的疊合方法，即保證所有分子取向的一致性，使分子間相互重疊時的均方根偏差最小。本文以五氯苯酚分子中的公共骨架，運用Align database模塊分別對訓(xùn)練集、測試集進(jìn)行疊合。訓(xùn)練集的疊合圖如下(測試集的疊合圖與圖1相同，故予以省略)。

2.2 CoMFA模型的建立

用訓(xùn)練集的疊合數(shù)據(jù)庫建立CoMFA模型。采用Tripos標(biāo)準(zhǔn)力場，對疊合分子周圍每個網(wǎng)格點上的立體場(steric, St)及靜電場(electrostatic, El)予以計算，場能閾值(Cut off值)設(shè)為125.5 kJ·mol-1，其余各項參數(shù)均為系統(tǒng)默認(rèn)值。在進(jìn)行偏最小二乘法(partial least squares, PLS)進(jìn)行分析時，首先采用逐一剔除法(leave-one-out, LOO)予以交叉驗證，以獲交叉驗證系數(shù)(Q2)和最佳主成分?jǐn)?shù)(N)。即以統(tǒng)計指標(biāo)Q2衡量模型的預(yù)測能力，Q2>0.5的模型，才具有95%的可信度[21]，所含機(jī)會相關(guān)的可能性小于5%。另外，將模型中的化合物數(shù)(m)與變量數(shù)(N)之比稱為“樣變比”，以“Sv”表示。Sv定義式為：

Sv = m/N

(2)

只有滿足Sv≥5的模型，才可能具有統(tǒng)計意義、穩(wěn)健性及較低或然性[22]。樣變比通過非交叉驗證進(jìn)行回歸分析，得到非交叉驗證判定系數(shù)(R2)、統(tǒng)計方差比(F)。最后采用View CoMFA模塊，以三維等勢圖直觀反映立體場和靜電場對化合物pI的貢獻(xiàn)，至此完成3D-QSAR模型。

3 結(jié)果與討論(Results and discussion)

3.1 CoMFA的3D-QSAR模型

訓(xùn)練集的CoMFA模型如下所述。(1) 交叉驗證部分：Q2=0.915>0.5，以及最佳主成分?jǐn)?shù)N=2，Sv = m/N=8>5，這表明模型具有很好的預(yù)測能力與穩(wěn)健性。(2) 非交叉驗證部分：R2=0.963>0.8，顯示良好擬合性；在95%顯著水平下，訓(xùn)練集CoMFA模型的F臨界值為F0.05(2,13)=3.88。該模型的F=169.137，遠(yuǎn)大于3.88，表明模型的因變量與自變量密切相關(guān)，具有統(tǒng)計學(xué)穩(wěn)定性。利用訓(xùn)練集的3D-QSAR模型對測試集中分子的pI進(jìn)行預(yù)測，以檢驗其預(yù)測能力。測試集的pI預(yù)測值見表1，與相應(yīng)實驗值基本吻合，表明模型確實具有良好的預(yù)測能力。另外，將表1中的實驗值與預(yù)測值關(guān)聯(lián)：

pIexp= 1.003pIcal- 0.006

(3)

該模型的R2=0.958，與訓(xùn)練集的R2=0.963非常接近，表明訓(xùn)練集CoMFA模型的穩(wěn)健性與良好的預(yù)測能力。

3.2 CoMFA等勢圖

圖2給出了以訓(xùn)練集中抑藻活性最高的分子20為模板的CoMFA模型的三維等勢圖，分子周圍不同顏色的塊狀圖表示氯酚類化合物的分子中取代基的立體場和靜電場對抑藻活性的影響。圖2(a)為取代基的立體作用分布圖，其中綠色表示在該區(qū)域增大取代基體積有利于提高化合物的抑藻活性，黃色區(qū)域表示減小立體位阻可提高抑藻活性。值得注意的是，僅有一小塊黃色區(qū)域在苯環(huán)的3、4位之間，且被綠色包裹；可以忽略其對抑藻活性的影響。由立體場的空間分布可知，在苯環(huán)的3、4和5的3個位置上引入體積較大基團(tuán)，有助于氯酚類化合物抑藻活性的提高。如在6個三氯取代苯酚的同分異構(gòu)體中，16號化合物(3,4,5-三氯苯酚)的抑藻活性最大，pI = 2.15。又如在3個四氯取代苯酚的同分異構(gòu)體中，17號化合物(2,3,4,5-四氯苯酚)的抑藻活性最大，pI = 2.41。因為這2個分子的3、4和5的3個位置上均有體積較大基團(tuán)氯原子存在。

圖2(b)為化合物周圍的靜電場分布，藍(lán)色表示在該區(qū)域增大基團(tuán)正電性有利于化合物活性的提高，然僅有一小塊藍(lán)色區(qū)域在苯環(huán)的1、2位之間，故可以忽略其對抑藻活性的影響。紅色區(qū)域表示引入帶負(fù)電荷的基團(tuán)對化合物活性有利。由靜電場的空間分布可知，在整個苯環(huán)的3、4和5的3個位置上都被大片紅色區(qū)域覆蓋，說明在這些位置上引入負(fù)電性基團(tuán)，有助于提高氯酚類化合物的抑藻活性。因此，在三氯酚中，16號化合物的抑藻活性最大。而在四氯酚中，17號化合物的抑藻活性最大。因為這2個分子的3、4和5的3個位置上均有負(fù)電基團(tuán)氯原子存在。

圖1 訓(xùn)練集的疊合圖Fig. 1 3D view of all the aligned molecules in training set

圖2 比較分子力場分析(CoMFA)模型的等勢圖注：(a)立體場，(b)靜電場。Fig. 2 The comparative molecular field analysis (CoMFA) contour mapsNote: (a) steric field; (b) electrostatic field.

訓(xùn)練集的3D-QSAR模型給出的立體場和靜電場對pIi的貢獻(xiàn)分別為48.4%和51.6%，顯示立體作用稍弱于靜電作用。立體場一般對應(yīng)空間位阻及疏水作用，靜電場主要為氫鍵及配位作用。文獻(xiàn)[15]報道：含氯苯酚類化合物對杜氏鹽藻產(chǎn)生毒性可能分為兩步，一是化合物穿過細(xì)胞膜進(jìn)入生物體內(nèi)，此與化合物的疏水性正相關(guān)；二是化合物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)作為電子給與體或氫鍵受體而與生物體內(nèi)的靶標(biāo)發(fā)生作用。因此，苯環(huán)上的取代基Cl越多，其疏水性越強(qiáng)，相應(yīng)毒性越大。但對三氯、四氯酚的同分異構(gòu)體，之所以16、17號毒性最強(qiáng)，是因為其他同分異構(gòu)體包含空間位阻，導(dǎo)致毒性降低。進(jìn)入細(xì)胞后，酚羥基與靶標(biāo)形成氫鍵，3、4和5位上的負(fù)電基團(tuán)氯原子與靶標(biāo)的配位及弱氫鍵作用，使化合物發(fā)揮更強(qiáng)的致毒作用。由此可見，本文研究結(jié)果與文獻(xiàn)[15]結(jié)論較為一致。與文獻(xiàn)[15]比較，本文具有2點創(chuàng)新：一是化合物透過細(xì)胞膜的能力不僅與分子疏水性有關(guān)，還與氯原子所處位置即空間位阻有關(guān)；二是進(jìn)入細(xì)胞后的致毒作用，除了酚羥基與靶標(biāo)形成氫鍵外，還與3、4和5位上的負(fù)電基團(tuán)氯原子與靶標(biāo)的配位及弱氫鍵密切相關(guān)。

綜上所述：(1)采用CoMFA方法研究氯代苯酚類化合物對杜氏鹽藻抑藻活性的三維定量構(gòu)效關(guān)系，獲得合理、可信及良好預(yù)測性的3D-QSAR模型：N = 2，Sv=8，Q2= 0.915，R2= 0.963，F(xiàn)=169.137。

(2)所建CoMFA模型三維等勢圖較好地解釋了訓(xùn)練集分子抑藻活性的差異，主要表現(xiàn)在苯環(huán)的3、4和5位上鍵合體積較大的負(fù)電基團(tuán)氯原子，利于抑藻活性增強(qiáng)。