腦細胞外間隙的電化學分析與成像研究進展

金靖　吳菲　于萍　毛蘭群

摘?要?腦細胞外間隙（Extracellular space， ECS）是指細胞膜外充滿液體的空間，約占腦體積的1/5。作為神經元和膠質細胞賴以生存的環境，ECS在為細胞輸送物質的同時，又能保障神經元靜息電位的穩定和動作電位的發生，與大腦的基本功能如突觸傳遞、記憶、睡眠和疾病的過程等息息相關。本文著重介紹了ECS的基本生物物理特性，綜述了利用電化學和成像方法開展體積分數和迂曲度研究的主要進展，并闡述了ECS在生理和病理過程中的變化規律。

關鍵詞?細胞外間隙; 電化學分析; 成像; 體積分數; 迂曲度;評述

1?引 言

作為人體的高級神經中樞，大腦在維持人體各項生理功能的過程中發揮著不可替代的作用，因此，腦科學研究對理解各種生命過程具有重要意義。腦神經系統的基本組成單元是神經元，人類的腦中有數千億神經元。腦神經功能的正常行使依賴于神經纖維的電信號傳遞和不同神經元之間突觸間隙的化學信號傳遞。除神經元外，腦內還存在大量的膠質細胞，占腦重量的1/2，數量是神經元的10～50倍[1]。膠質細胞雖然缺乏傳遞電信號的功能，但其通過營養、保護、調節等多種方式維系神經元活動，在神經活動中也扮演著重要的角色。腦作為人體最重要的器官，除腦細胞外，細胞之間的間隙（如突觸間隙）也在腦神經生理和病理過程發揮著重要的作用。

腦細胞外間隙（Extracellular space， ECS）[2]是指神經細胞膜外充滿液體的空間，主要包括細胞間隙、血管和腦室等。腦室充滿無色透明的液體，即腦脊液（Cerebrospinal fluid， CSF）。在人的CSF中，除葡萄糖、少量蛋白和少量的單核細胞、淋巴細胞外，還包括無機鹽離子，如Na+（約150 mmol/L）、K+（約3 mmol/L）、Ca2+（約1.2 mmol/L）、Mg2+（約1.2 mmol/L）、Cl（約120 mmol/L）和HCO3（約20 mmol/L）。細胞間隙充滿細胞間液，與CSF成分類似，但與CSF不同的是，細胞間液中含有長鏈大分子的細胞外基質，包括硫酸軟骨素、硫酸肝素、透明質酸和膜蛋白質等[2～4]。此外，細胞外基質是負電性的，可能影響離子或帶電分子在ECS中的傳遞。盡管ECS還包括血管和腦室，但ECS的研究主要是針對細胞間隙而展開，一般會忽略ECS和細胞間隙的差別。ECS特性的研究對理解和認識腦功能具有重要意義[3，4]。一方面，ECS為神經元提供豐富的離子，保證靜息電位的維持和動作電位的發生，從而實現穩定的電信號傳遞;另一方面，ECS為細胞輸送營養物質、代謝產物和信息分子，保障細胞的生存需求并介導細胞間的通訊。此外，ECS在神經突觸和細胞連接的重塑過程中也發揮重要作用。

長期以來，腦科學研究多集中于神經元和膠質細胞構成的神經網絡，而對于ECS的研究卻相對較少。直到20世紀中葉，ECS才受到關注。目前，ECS的研究主要集中在部分微區的結構變化和分子的擴散行為。本文介紹了ECS的生物物理特性，以ECS兩個參量（體積分數和迂曲度）為研究對象，對ECS的主要研究方法以及ECS在腦生理和病理過程的變化規律研究進行了評述。

2?生物物理特性

ECS具有非均勻性和各向異性[5，6]。非均勻性是指不同位置的腦組織其ECS有所差別，體現在不同腦區和亞區。例如，烏龜小腦皮層的顆粒細胞層ECS和分子層ECS有明顯差別[5]。ECS是各向異性的，其流體流速和分子擴散是矢量的，換言之，它們既有大小又有方向。例如，分子更容易沿著軸突束傳遞，而不是橫向穿過軸突束[6]。目前主要通過以下若干生物物理參量對ECS的結構進行描述。

體積分數（Volume fraction， α）代表ECS的體積占腦體積的百分比[7]，即α=VECS/Vtissue。α具有非均勻性且動態變化，不同生理和病理狀態的α不同，通常α在0.15～0.30之間，但全腦發生缺血時會導致細胞發生水腫，α會下降至0.05[8，9]。

分子在ECS中以擴散（Diffusion）的形式傳遞時會受到腦組織結構的阻礙，這種阻礙作用可用迂曲度（Tortuosity， λ）表示[7]。λ = （D/D*）1/2，其中，D為分子的自由擴散系數，D*為分子在腦組織中的有效擴散系數。λ反映了分子在ECS中擴散的難易程度。在健康的腦中[7]， λ≈ 1.6。

細胞間隙的真實距離很難直接測得。電子顯微鏡表征細胞間隙為10～20 nm[10，11]; 而有些外源性大分子，如聚蔗糖（水合半徑為20 nm）或量子點[12]（水合半徑為17 nm），可在細胞間隙擴散，即至少一部分細胞間隙具有足夠的距離，允許這些大分子通過。

體流（Bulk flow）[13]的來源尚未明確，可能是血腦屏障分泌的液體在細胞間隙流動，之后匯入腦脊液或進入淋巴管。文獻[14，15]提供了體流最直接的證據。Cserr研究組[16]還檢測了不同分子的流出速率，雖然其擴散系數有明顯差別，但流出速率基本一致。他們還認為，體流僅發生在毛細血管的周圍間隙[17]。據估計，腦白質[18]體流流速約為10.5 μm/min。

3.1?ECS的研究歷史

20世紀中葉，關于ECS的爭論十分激烈[11]。一方面，通過固定腦組織，以電子顯微鏡為手段直接觀測二維區域的ECS（圖1）[19]。 然而，該方法只能測定α，且僅限于失活的腦組織; 此外，腦組織經過固定和化學處理后有可能導致ECS的變化。最初電鏡顯示[11，20]，ECS僅占腦體積的5%，甚至無法觀測到ECS; 而腦組織通過冷凍技術固定[21]后，測得α為0.15～0.20。 但是，冷凍過程形成的冰晶有可能會增大α。另一方面，以細胞膜外探針分子或標記物的擴散分布可量化三維區域ECS[21]，該方法可同時測定α和λ。更重要的是，擴散方法可在活體上研究ECS的動態變化。然而，該方法對探針分子的要求較高。早期實驗測量腦中Na+和Cl分布的結果表明，ECS可能占據高達40%的腦體積[11]。而研究人員意識到Na+和Cl在細胞內有明顯的分布后，使用放射標記的蔗糖和菊粉測量ECS的α為0.15～0.20[21]。

Rall＼， Fenstermacher和Patlak是利用擴散方法研究ECS的先驅[21～23]，他們通過研究放射性示蹤劑在腦內的擴散，反映ECS的結構特征。在早期研究中，研究人員將放射標記的蔗糖或菊粉注射至動物腦室，通過腦切片獲得其分布，并測得α為0.15～0.20，λ為1.52～1.64。放射性示蹤劑的擴散發生在活體中，但定量是在動物處死后某一時間點進行的，因此該方法沒有得到普遍使用。盡管如此，其獲得的數據可為其它方法提供獨立的驗證。不使用放射性示蹤劑的實時分析技術最早由Lux等[24]建立，后來得到了Nicholson等[7]的改進。如圖2[19]所示，該方法先將探針離子或分子從玻璃毛細管中釋放到腦組織后，探針在ECS發生擴散，然后在不同的位置利用離子選擇性微電極或碳纖維電極，結合電位法、伏安法或安培法等電化學方法，檢測所釋放的探針濃度，依據Fick第二定律得到ECS的生物物理參數。該方法能夠研究多種探針在可控距離的擴散，并實時監測探針在ECS的擴散和代謝情況，且不受腦區深度限制，是目前較理想的研究ECS的方法之一。

3.2?理論基礎

探針被遞送到ECS后會發生擴散，利用合適的方法對探針進行檢測，可反映ECS的某些生物物理特性。通常，檢測的距離約100 μm，短距離可確保ECS的均勻性。探針在ECS中的擴散基本符合Fick第二定律，但需要進行合理的修正[3，4，7，11，25]：

Ct=Dλ2SymbolQC@

2C+Qα-v·SymbolQC@

C-f（C）α（1）

等號左邊是給定位置探針濃度C隨時間t的變化。等號右邊第一項是擴散本身的貢獻; 第二項是玻璃毛細管在ECS中釋放探針的量Q; 第三項表示體流的可能貢獻，其為速度矢量v和濃度梯度C的乘積; 最后一項f（C）表示探針在ECS中的不可逆損失。

探針的選擇非常重要，不合適的探針不能準確反映ECS。本質上，ECS的研究目的決定使用探針的類型。第一類研究通過量化兩個生物物理參數（α和λ）反映ECS的性質。為此，探針應滿足以下要求[4，7]：分子足夠小且是水溶性的，以探索腦內所有區域的ECS; 對腦組織無毒且濃度足夠低，不影響腦組織的滲透壓; 與ECS無相互作用且不易被清除，能準確測定其濃度。這種理想的探針將探索ECS的所有通道，并真實反映ECS性能參數。第二類研究則使用不同于上述要求的探針，來嘗試解決以下問題：細胞間隙大小; 分子之間或分子與細胞外基質的相互作用（非特異性或特異性結合）; 分子是否進入細胞或穿過血腦屏障。這樣的探針可能不會到達ECS的所有通道，也可能被保留在ECS或進入細胞。

4?ECS的研究方法

ECS的研究方法按測量方法可分為形貌測量法（電子顯微鏡）、電化學方法（電位法、伏安法和安培法）、光學方法和磁共振成像法; 按ECS中分子傳遞方式可分為擴散方法和電滲方法; 按探針遞送方式可分為直接注射法、離子導入法和壓力導入法。本文以ECS兩個主要生物物理參數（α和λ）為測定對象，對ECS的主要研究方法進行分類評述。

4.1?體積分數（α）的測定方法

目前，除電子顯微鏡和放射性示蹤法，可測定α的方法還有實時離子導入法。實時離子導入法（Real?time iontophoretic method， RTI）[7，26]是通過離子導入的方法，將探針離子導入腦組織，并用離子選擇性微電極（Ion?selective microelectrode， ISM）[27～33]實時監測探針離子的濃度，從而測定ECS的生物物理參數。RTI可同時測定ECS的α和λ，是目前研究ECS常用方法之一。

離子導入是指離子在電流的作用下釋放到ECS中， 優點是可通過離子導入電流精確調控離子釋放。離子導入是通過玻璃毛細管實現的。玻璃毛細管尖端直徑為3～6 μm，內部填充0.1～1.0 mol/L的離子溶液，并插入一根Ag/AgCl絲作為電極，然后密封毛細管尾端防止管內液體蒸發。其中，3～6 μm的尖端既能避免直接插入細胞， 不會對腦組織造成較大的損傷。如圖3A所示，離子導入管中的Ag/AgCl絲與恒電流源連通，并與瓊脂中的對電極構成回路，離子從玻璃毛細管尖端導出[19]。以0.3%的瓊脂凝膠（含150 mmol/L NaCl）為自由擴散基質（α=1）， 計算探針的自由擴散系數和遷移數（Transport number， nt）。瓊脂凝膠的使用可排除水或等滲溶液中熱對流的干擾。式（1）在RTI中修正為[7，34]：

Ct=Q8πD*αr[erfcr2?D*t+?k'texpr?k'D*+erfcr2?D*t-?k'texp-r?k'D*（2）

式（2）為開始并保持離子導入后在距離毛細管尖端r處的離子濃度C。其中，erfc為余誤差函數。

Q=IntzF（3）

其中，I為離子導入電流 ，nt為導入離子的遷移數， z為離子的化合價， F為法拉第常數。

在RTI中， 常用的探針如表1所列。四乙基銨陽離子（Tetraethylammonium， TEA+）是第一個利用RTI方法研究ECS并準確測定α和λ時使用的探針。TEA+是細胞內電壓門控的鉀離子通道阻斷劑[4]。四甲基銨陽離子（Tetramethylammonium， TMA+）由于具有比TEA+弱的K+阻斷效果和小的尺寸， 被廣泛應用于ECS的研究。此外，帶負電荷的離子（六氟砷酸鹽（Hexafluoroarsenate， AsF6

）、α?萘磺酸鹽（α?Naphthalenesulfonate， α?NS

由于光學方法自身的缺陷，IOI通常局限于腦最淺表的200 μm左右，且僅限于研究大腦灰質等沒有明顯光散射的區域[61]。目前，雙光子成像[36， 61～64]已初步用于大鼠紋狀體的探針擴散研究，雖然獲得的信噪比比較低，但這種方法很可能成為深度腦區ECS的重要研究方法。Zheng等[64]將時間分辨熒光各向異性成像技術與雙光子激發顯微鏡技術結合，在切片上觀測到ECS中分子的擴散。他們發現，在海馬腦區細胞間隙中小分子的擴散系數是自由擴散系數的70%，而突觸間隙中小分子的擴散系數是自由擴散系數的54%。此外，超分辨成像也能對ECS進行更精準的描述。Godin等[60]以注入腦室的單壁碳納米管為探針，檢測單個探針的近紅外發射，進而反映出ECS的寬度和局部黏度信息。Tonnesen等[65]將熒光標記技術和三維的受激發射損耗顯微鏡（Stimulated emission depletion， 3D?STED）相結合，建立了腦ECS的超分辨陰影成像（Super?resolution shadow imaging， SUSHI）。該方法能從一定程度上緩解傳統光學成像造成的光漂白和光毒性問題，能夠定量給出ECS的結構和動力學信息。

4.2.3?磁共振成像法?作為一種非侵入性技術，磁共振成像法（Magnetic resonance imaging， MRI）[66～72]因基于水的核磁特

征可實現人體和大腦的成像，廣泛應用于臨床。MRI可通過擴散加權成像（Diffusion weighted imaging， DWI）測量體內水分子的表觀擴散系數和組織各向異性。基于MRI的ECS研究以水分子作為探針，但水分子擴散也同時存在于細胞內，因而無法準確描述ECS性質。而利用外源性探[73]（如苯丙醇胺、甘露醇、PEG等）得到的λ為1.75～1.83，則略高于RTI的結果。

Han研究組[74～80]開發的MRI示蹤法可在全腦動態觀察ECS，并獲得其擴散參數。該方法采用釓?二乙三胺五乙酸（Gadolinium?diethylene triaminepentaacetic acid， Gd?DTPA）為探針，作用于距離探針0.24 nm的水分子的氫原子核。通過縮短氫核弛豫時間和動態掃描采集圖像信息，進而獲得ECS的擴散系數。利用該方法，他們發現大鼠尾狀核和丘腦雖然鄰近，但兩區域的細胞間液無法相互溝通且流動速度和分布范圍均不相同。這表明ECS可能存在不同腦區的分區系統[75]。此外，他們利用該方法也發現大鼠給予疼痛刺激后，丘腦和尾狀核的ECS流量明顯減慢[76，77]。Song等[81]用該方法研究大鼠神經膠質瘤腫塊中ECS的變化。

除Gd?DTPA為探針外，Madelin等[82， 83]提出一種基于鈉磁共振成像的方法，可估算腦細胞內鈉濃度，并計算出ECS的α。他們對5名健康志愿者進行細胞內鈉的檢測，均值為11 mmol/L，灰質的α=0.22，白質的α=0.18，與健康腦組織標準值（鈉濃度： 10 ～15 mmol/L，α≈0.2）接近。

4.2.4?電滲測量法?雖然對ECS中物質的擴散行為具有較好的理解，但對于電介導的物質傳遞卻知之甚少。在ECS中，與負電性的細胞外基質抗衡的正離子會在電場作用下帶動細胞間液發生流動，從而產生腦內的電滲流。Weber研究組[84～90]利用電滲（Electroosmosis，EO）在海馬腦區測定ECS的λ和ζ?電勢。如圖5所示，其在腦片上引入熒光分子作為探針，施加約22 V/cm的電場，探針在電泳和電滲的共同作用下發生移動，通過下列公式，可求得ECS的λ和細胞外基質的ζ?電勢。

中，vobs為測量的速度，veo為電滲速度，vep為電泳速度， μ為遷移率，E為電場強度， η為介質黏度， ε為介電常數。實驗測得海馬ECS的λ=1.83±0.06， ζ?電勢=（

22±2） mV，其亞區CA1椎體細胞層、CA3椎體細胞層和齒狀回的ζ?電勢分別為（

25.4±1.0） mV。此外，利用腦ECS的電滲現象，可定量檢測ECS中的半胱氨酸濃度[86， 87]和酶活反應[88]等。

5?ECS的生理和病理變化

5.1?不同腦區ECS的差異

腦組織結構復雜，具有不均一的各向異質性。即使是同一物種，不同腦區的α和λ也存在較大的差別。表2總結了活體原位測得的成年大鼠的皮層、胼胝體、海馬、紋狀體、小腦和脊髓的α和λ。總體而言，神經纖維豐富的腦組織（胼胝體）因存在較多間隙，分子擴散較快; 而在神經元與膠質細胞較為緊密的腦實質區（皮層），分子擴散常受到限制。

5.2?發育過程中腦ECS的變化

在發育過程中，腦ECS是動態變化的。從出生到成年再到衰老，α隨個體的發育逐漸降低，但λ并無明顯的變化。新生大鼠[98]在出生的第二天（P2）到第四天（P4），其α約為0.4，但是在P10～P11，α減小至0.27， P23時α和成年大鼠基本接近。然而λ在發育過程中基本保持在1.5～1.6之間，可能是因為大的ECS促進發育相關的分子的運動，并為細胞遷移提供更寬的通道。在衰老過程[95]中，α從0.21～0.22降低至0.17～0.19，而λ基本不變。此外，有研究表明，α與學習能力相關，行為學表現越良好的老年鼠α越大。總之，α隨年齡增長而下降，λ基本保持不變。

5.3?不同干預和病理模型的ECS

5.3.1?滲透壓變化?Krizaj等[103]研究了烏龜小腦的ECS在不同滲透壓下的變化，發現在生理鹽溶液（302 mosmol/kg）、低滲溶液（238 mosmol/kg）和一系列高滲溶液（最高滲透壓為668 mosmol/kg）中，α依次為0.22、0.12和0.6（668 mosmol/kg），λ依次為1.70，1.79和1.50。Kume?Kick等[104， 105]研究了滲透壓對哺乳動物ECS的影響。結果表明，大鼠皮層在生理鹽溶液（305 mosmol/kg）中α=0.24， λ=1.69; 在低滲溶液（150 mosmol/kg）中，α減小至0.12，λ升高至1.86; 在高滲溶液（最高500 mosmol/kg）中，α穩定上升至0.42，而λ在滲透壓為350 mosmol/kg的溶液中為1.67，之后穩定不變。

5.3.2?腦缺血/缺氧?腦組織出現缺血或缺氧時，ECS中的離子濃度迅速發生變化，其中K+濃度急劇上升至50～70 mmol/L，Na+濃度迅速下降至48～59 mmol/L，Cl

濃度下降至70～75 mmol/L，Ca2+濃度下降至0.06～0.08 mmol/L，pH下降至6.4～6.6。大量Na+和Cl

進入細胞后，水分子也進入細胞，造成細胞水腫，從而改變ECS。當大鼠發生缺血/缺氧時[8，9，57]，脊髓和皮層的α從0.20最低下降到0.05，λ則由1.5上升至2.1。

5.3.3?帕金森綜合癥?帕金森綜合癥是一種常見的神經退行性疾病。在動物黑質或紋狀體腦區注射6?羥多巴胺（6?Hydroxydopamine， 6?OHDA）能成功誘導帕金森模型，而將幼鼠的多巴胺能神經元移植到6?OHDA損傷的紋狀體可使其功能恢復[106]。研究發現[100]，未注射6?OHDA之前，紋狀體的α=0.19， λ=1.59; 建模后紋狀體的α為0.14，λ為1.50; 而將幼鼠的多巴胺能神經元移植到損傷部位后，α=0.24， λ=1.80。

如表3所示，其它模型中，如電刺激、擴散性抑制、癲癇、高血鈉和戳傷等，ECS也會發生變化。

6?總結與展望

腦ECS占腦體積的20%左右，為腦細胞的生存和信息交流提供了必要的條件。與自由溶液相比，分子在ECS中擴散受到阻礙，溶液中自由擴散系數約為ECS中擴散系數的2.6倍。此外ECS是動態變化的，在大腦生理和病理狀態下，ECS的α和λ均會發生改變。然而，由于對ECS的認識不足，目前對所有結果尚難有明確的解釋。

為深入理解ECS在腦功能實現過程中的作用，研究學者發展了多種活體分析方法和技術，其中以TMA+為探針的RTI是較成熟的研究方法之一。RTP和IOI則可選擇多種分子作為探針，豐富了ECS的研究。MRI作為一種無損技術，極有可能發展為人腦ECS的研究方法。除探針在ECS中的擴散，電滲測量法從新的角度闡述了ECS中物質的傳遞。

雖然人們逐漸認識到ECS的重要性，但ECS的研究仍面臨諸多挑戰：（1）目前的方法大多集中在對ECS的α和λ的研究，然而針對其它生物物理性質的研究基本空白; （2）現有方法只能測定距離腦表層200 μm深度的ECS，深部腦區的ECS活體研究方法亟需發展，而清醒自由移動動物的ECS研究目前尚無良策; （3）除MRI外，大多數方法只能研究以毛細管尖端為中心的200 μm左右的微小區域， 缺乏對全腦ECS的整體認識; （4）探針在ECS中擴散的理論弱化了體流和分子的不可逆損失部分，而分子在ECS的真實表現仍不清楚，需要進一步加強ECS中分子與細胞外基質相互作用的研究，甚至單分子行為的研究，以加深對ECS的理解和認識。

目前，人們認為腦信息傳遞的途徑除神經纖維的電信號傳遞和突觸間隙的化學信號傳遞外，還應存在以ECS為主要途徑的容積傳遞。建立和發展新的分析化學原理和方法，深入系統開展ECS的研究，不僅能夠有助于理解物質在ECS傳遞，而且還能從新的角度闡述腦的生理過程和病理機制，為人類認識腦和利用腦奠定重要的基礎。

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Progress of Electrochemical Analysis and Imaging

of Extracellular Space

JIN Jing1，2， WU Fei 1，2， YU Ping1，2， MAO Lan?Qun*1，2

1（Beijing National Laboratory for Molecular Science， Key Laboratory of Analytical Chemistry for Living Biosystems，

Institute of Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100190， China）

2（University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

Abstract?Extracellular space （ECS） is the fluid?filled space surrounding the brain cells， accounting for about one fifth of brain volume. As an essential living environment for neurons and glial cells， ECS not only transports substances for cells， but also enables stable electrical signaling. Therefore， it is closely related to the basic functions of the brain， such as synaptic transmission， memory， sleep and diseases. This review focuses on the primary biophysical characteristics of ECS and the main progress on investigating volume fraction and tortuosity with electrochemical analysis and imaging methods. The review also expounds on the variation of ECS in physiological and pathological processes.

Keywords?Extracellular space; Electrochemical analysis; Imaging; Volume fraction; Tortuosity; Review