植入式柔性神經電極在活體腦電信號檢測中的研究進展

王晉芬　田慧慧　方英

摘?要?植入式神經電極是記錄神經電生理信號的一種重要工具，具有單細胞的空間分辨率和亞毫秒級的時間分辨率，在神經科學和神經修復領域具有重要的應用。微納米加工技術的發展，為植入式神經電極的構建提供了更多的解決方案。基于微納米加工的植入式剛性電極，由于存在與大腦組織的力學性能不匹配的問題，容易造成大腦組織的免疫反應，影響神經電信號的長期穩定測量。而近年出現的新型植入式柔性神經電極，可與腦組織形成兼容性的界面，引起的免疫反應小，有利于神經電信號的長期穩定測量。此外，植入式柔性神經電極的微型化、高密度和多功能集成也是腦研究新技術的研究熱點。本文主要對近年用于活體腦電信號檢測的植入式柔性神經電極的相關研究進展進行了評述，包括柔性神經電極結構、電極組織界面、植入方法、微型化方法和集成方法等。

關鍵詞?柔性神經電極; 植入式神經電極; 免疫反應; 電生理記錄; 活體; 評述

1?引 言

神經電極作為連接生物信息系統和電子信息系統的接口，是一種記錄神經電活動的重要工具。其中，植入式神經電極由于其高的時間分辨率和空間分辨率[1]，可對單個神經元的電活動進行記錄，在腦環路研究、神經假體研究和腦機接口研究等領域具有重要的應用前景。目前，采用微納米加工工藝制備的植入式神經電極多是基于硅材料，如記錄較深部核團中不同層神經元電活動的密西根電極（Michigan probe）[2，3]和記錄大范圍皮層腦電信號的猶他電極（Utah electrode）[4，5]。硅基神經電極為剛性電極，其楊氏模量約為100 GPa，而大腦組織的楊氏模量約為10 kPa[6]，當剛性電極植入大腦后，由于力學性能不匹配，容易造成大腦組織的損傷，使神經電極無法與腦組織之間形成緊密的界面。另外，由于腦組織的微移動，會造成大腦組織與剛性電極之間產生摩擦，引起大腦的免疫反應[7，8]，產生大量的纖維狀或細胞狀組織，包覆在電極周圍，從而阻斷神經電極與神經元之間的電信號傳輸，造成電極失效。

研究者認識到柔性電子對神經電信號檢測的重要性始于20世紀60年代[9]，而后，隨著基于微納米加工技術的密歇根電極[10]和尤他電極[11]的出現，柔性神經電極的研究快速發展。柔性神經電極是將神經電子器件制作在柔性或可延展性基板上的電子技術，由于其具有與大腦組織相匹配的力學性能[12]，引起的免疫反應小[13]，還可與腦組織的曲面結構進行良好的貼附[14，15]，由此發展了多種新型的柔性神經電極技術。但是，由于柔性材料的楊氏模量較小，植入過程中容易發生彎曲變形，不易精準植入目標腦區。多種輔助方法，包括可去除的輔助植入物[16，17]、聚合物模板[18，19]等，已被用于提高植入式柔性神經電極的剛性，成功實現了柔性神經電極的精準植入。

神經環路研究的一個巨大挑戰是實現大量神經元活動的同時記錄，并達到單個細胞神經活動的高分辨測量。因此，設計和制備具有小尺寸和低創傷的高密度神經電極是一個研究熱點[2，20]。另外，神經調制技術的設計更加復雜和精妙，需要將神經電極與光遺傳[21，22]、電刺激[23，24]及載藥[25]等技術進行集成。本文主要對近年出現的柔性神經電極的結構、植入方法、微型化、高密度及多功能集成等方向的研究進展進行了評述。

2?新型柔性神經電極結構及植入方法

2.1?大范圍記錄的柔性網格神經電極

柔性網格神經電極（NeuroGrid）是一種基于柔性有機材料基底的神經電極陣列，由于采用網格狀結構設計，雖然彈性基底發生彎曲變形，但無機導電材料并不失效，因此具有良好的貼附性和可延展性[15，26]。NeuroGrid采用標準的微納米加工工藝制備，金屬鉑或者金作為連接線，聚對二甲苯作為絕緣材料。電極位點的密度與胞體大小和神經元密度相匹配，記錄位點的尺寸為10 μm×10 μm，電極之間的間距為30 μm，器件照片見圖1A[15]。NeuroGrid的高度可延展性使其能夠覆蓋小動物的整個背側皮層或是人腦的多個皮層區域，圖1B為NeuroGrid與大腦形成的共形界面[26]。電極位點的表面采用聚苯乙烯磺酸（PSS）摻雜的聚（3，4?乙烯二氧噻吩）（PEDOT）導電聚合物修飾，可大大降低電極與大腦組織之間的阻抗，從而更有效地進行信號傳輸，NeuroGrid的阻抗分布圖和單個電極位點的阻抗圖見圖1C[26]。上述電極設計為NeuroGrid的高信噪比和穩定信號記錄提供了有利的保障，因此，NeuroGrid不用刺入大腦，即可從大腦皮層的表面獲取神經元的場電位和動作電位信號。圖1D為NeuroGrid記錄到的高頻神經電信號及分離出的動作電位[15]。 NeuroGrid可記錄到典型的中間神經元和錐體神經元的發放，穩定記錄到動作電位的時間超過1周。此外，NeuroGrid還可用于外科手術中癲癇病人和語言功能定位任務中的場電位和動作電位監測。圖1E和1F為外科手術中，病人保持清醒狀態時，執行語言定位任務記錄到的場電位信號和頻譜圖。結果表明，NeuroGrid和常規臨床方法均可記錄到清醒狀態時出現的典型特征峰。NeuroGrid具有以下創新性的特點：不用刺入大腦即可獲取穩定場電位和動作電位信號、與大腦共形的結構有利于穩定的電學接觸和機械接觸、高效的非生物/生物界面有利于信號的高信噪比獲取、高的延展性和結構設計的多樣性，以及與神經元匹配的電極密度有利于單個神經元動作電位的分離。

2.2?可注射柔性網格神經電極

由于柔性神經電極的楊氏模量較小，很難精準植入特定腦區。Liu等[13]采用注射器輔助的外科方法，將柔性網格神經電極精準地植入目標腦區。可注射柔性網格神經電極（Syringe?injectable mesh electronics）的機械性能對于注射過程非常重要，網格需非常柔軟，而且應能發生卷曲，組裝入直徑很小的注射器中[27～30]。網格電極采用SU?8聚合物/金屬/SU?8聚合物夾心結構，由呈一定角度的橫向和縱向細絲結構組成，如圖2A所示[30]。這種結構設計可加速柔性網格神經電極向橫向方向彎曲，彎曲后的柔性網格神經電極可成功裝入注射器或者玻璃微管（圖2B）[13]，而后從針管里注入目標位置（見圖2C）[29]，最后釋放出用于電路連接的輸入輸出端口。其中，2 mm和1.5 cm寬的柔性網格電極可卷曲成95 μm和600 μm的直徑。注射至大腦后，柔性網格神經電極的阻抗變化量小于7%，說明柔性網格神經電極具有較好的穩定性，針管注射的方法具有較好的可靠性。可注射柔性網格神經電極可用于海馬等腦區的長期場電位和動作電位的測量，實現了對同一神經元8個月的穩定跟蹤測量[27]。另外，可注射柔性網格神經電極可擴展至32通道或128通道（圖2D）[28]，用于高密度神經電信號的獲取，實現了神經信號的長期穩定跟蹤測量（圖2E）[28]。對可注射柔性網格神經電極與大腦組織界面的免疫反應進行了長達一年的研究（圖2F）[29，30]，共聚焦顯微鏡的結果顯示，柔性網格神經電極與大腦組織界面的星型膠質細胞、小膠質細胞和神經元的分布沒有發生明顯的改變。此外，通過調控可注射柔性網格神經電極的結構和機械性能，可形成類神經元電子器件，該器件的厚度只有900 nm，與軸突的力學性能匹配[31]。類神經元電子器件可穩定地讀取神經活動，而且在植入早期可記錄到新的神經元動作電位。免疫染色結果也證實了新神經元的產生，表明類神經元電子器件可能參與了內源性神經干細胞的調制過程，包括吸附和遷移過程。可注射柔性網格神經電極引起的免疫反應小，可與神經組織形成無縫界面，在神經活動記錄和神經調制等方面具有較好的應用前景。

2.3?高密度柔性神經流蘇電極

大腦中的神經元具有尺寸小、密度高、數量大等特點，如大腦皮層中神經元密度約105個/mm3 [32]。 因此，神經電極記錄的神經元個數越多，可獲取的大腦神經活動越多。基于硅基的植入式神經電極Neuropixels，在一個柄上可集成數百個可尋址的電極位點，實現了多個腦區數百個神經元的電活動記錄[2]。而柔性神經電極由于其楊氏模量較小，在植入過程中易發生彎曲變形，很難將多根柔性神經電極同時植入大腦組織，限制了柔性神經電極對神經電信號的高通量記錄。本研究組[19]報導了一種柔性神經流蘇電極（Neurotassel），可實現柔性神經電極的高密度集成。柔性神經流蘇電極采用微納米工藝制備，由平面?網格?纖維電極三部分組成，過渡的力學結構保證了柔性神經流蘇的穩定性。記錄位點位于纖維電極結構上，電極的輸入和輸出端采用聚酰亞胺絕緣的金屬連接線導出，而后通過倒裝焊的方法與后端電路連接。通過巧妙設計，將神經流蘇浸沒在熔融的聚乙二醇液體中，在液體表面張力的作用下，柔性神經纖維電極自組裝形成針狀的高密度神經流蘇/聚乙二醇復合細絲，柔性神經流蘇的組裝圖見圖3A，組裝后的形貌圖見圖3B。16通道的神經流蘇/聚乙二醇復合細絲的直徑僅為55 μm，1024通道的神經流蘇/聚乙二醇復合細絲的直徑約為100 μm（圖3C）。其中，1024通道的每個柔性神經纖維電極的截面只有3 μm×1.5 μm， 達到了神經元軸突的尺寸，可極大地降低手術植入過程中電極對腦組織的損傷。聚乙二醇可在腦組織內降解代謝，釋放后的超細柔性神經纖維電極能夠原位、精準測量清醒大腦內側前額葉皮層中多個神經元的電活動（圖3D）。在小鼠學習嗅覺工作記憶任務（Delayed pair?association task， ?DPA task，）中，神經流蘇可穩定跟蹤同一神經元的電活動3～6周（圖3E），比傳統微絲四電極更穩定，能得到更多有關小鼠在學習能力上升過程中神經元發放特性變化的細節信息，有利于研究認知功能過程相關的神經機制。尤其重要的是，免疫分析結果顯示，柔性神經流蘇電極植入后，對電極周圍的神經元損傷小，這是因為柔性神經流蘇與腦組織的力學性能相匹配，形成了良好的相容性界面，從而實現了對活體大腦神經元電活動的長期穩定記錄（圖3F）。此外，柔性神經流蘇電極還可與光纖進行集成，用于光遺傳和電生理的同步檢測（圖3G）。目前，柔性神經流蘇技術在電極尺寸、集成密度和生物相容性方面的研究進展，將為腦科學和腦疾病研究提供新方法，在腦機接口和神經修復等領域具有較好的應用前景。

3?超微柔性神經電極

為了減小植入物對大腦組織的影響，降低植入物的尺寸是一種非常有效的方法。以帶狀電極為例，其彎曲強度（kB）的定義如下：

kB=Eswh312（1）

其中，Es為電極材料的楊氏模量，w為電極的寬度，h為電極的厚度。因此，減小植入器件的尺寸，會降低彎曲強度，使其與大腦更加匹配，并能進一步降低機體的神經膠質反應，減少植入物對大腦微環境的影響。Luan等[16]提出了一種超微的納米電子神經探針，即納米電子線（NET，nanoelectronic thread）（圖4A）。采用多層光刻工藝制備了兩種結構的NET電極（NET?50和NET?10），結構表征圖見圖4B。NET?50具有8個記錄位點，厚度和寬度分別為1和50 μm; NET?10在正反兩個表面共分布4個電極位點，電極的橫截面積為10 μm×1.5 μm。

由于較小的尺寸和厚度，NET的彎曲強度降低至1015N m2，可將神經電極與組織之間的界面相互作用力降低至109N量級。

采用7?μm的碳纖維和20?μm的鎢絲可輔助NET植入大腦組織（圖4C），植入所引起的創傷小于100 μm（圖4D），有利于組織的后期恢復。植入2個月或5個月后，采用雙光子對NET電極周圍的毛細血管、膠質細胞和神經元變化進行監測，

發現血腦屏障只受到了較小的影響，而膠質細胞和神經的密度沒有明顯變化，說明NET電極具有較好的生物相容性，能與神經組織形成穩定的界面（圖4E）。將NET電極植入大腦組織考察電極的長期記錄性能，在最初的1.5個月，NET的記錄性能逐漸趨于穩定，4個月后仍能保持較好的記錄性能（圖4F）。NET電極長期的穩定性和可靠性，使其在基礎神經科學、應用神經科學領域和腦機接口領域具有較好的應用前景。

4?多功能柔性神經電極

可控的刺激或抑制是研究行為學和電生理關系的一個有效方法。通過選擇性激活或抑制特定的細胞，可加快細胞外復雜的神經網絡研究。傳統的電刺激方法由于空間分辨率低、非特異的刺激及不穩定的抑制，不能用于細胞的可控刺激。光遺傳是一種具有高的時間和空間分辨率的細胞特異性調控方法。對深腦的細胞進行光遺傳控制并同時進行電生理記錄為神經科學研究提供了一種新手段[33]。Kim等[22]發展了一種與大腦機械性能匹配的超薄多功能光電子系統，該系統可進行腦電信號的無線傳輸和自由活動小鼠行為的程序控制。微型的有機發光二極管（Inorganic light?emitting diodes，μ?ILEDs））光源結合電子傳感器和執行器組成了多功能化光電子系統，該系統包括以下功能部分： 鉑電極用于電生理記錄和電刺激調控; 微型的光學探測器用于光密度測量; μ?ILEDs陣列用于發射光源; 精密的溫度傳感器和加熱器用于溫度控制; 蠶絲蛋白制作的微針用于輔助植入（圖5A）。圖5B是μ?ILEDs陣列的器件圖。

多功能化光電子系統的厚度為20 μm，表現出低的彎曲強度和高的機械柔韌性（圖5C），可大大降低植入引起的創傷（圖5D）。免疫結果進一步表明，μ?ILEDs器件在植入4個月后未引起明顯的損傷和膠質疤痕（圖5E）。另外，該系統具有優異的光遺傳調控和電生理記錄功能，為光遺傳調控和電生理的同時記錄提供了保障（圖5F和5G）。最后，將該多功能光電子系統用于小鼠的Y?迷宮行為學實驗，發現光遺傳調控的小鼠表現出了更強的位置取向性（圖5H）。該多功能光電子系統具有高效的光和熱調控能力，良好的電生理記錄性能。小的機械損傷和免疫反應，在神經基礎科學和相關領域具有較好的應用前景。

5?結論與展望

近年來，多種新型的植入式柔性神經電極被用于活體腦電信號檢測，在柔性神經電極的構建材料、結構設計和制作工藝等方面取得了很多重大進展。新型調控和檢測技術的出現及其與柔性神經電極技術的集成，如光遺傳技術與柔性神經電極技術的結合，創造了腦功能研究的新機遇。但是，隨著神經科學研究的精密化，需要更高的時間和空間分辨率、更長的記錄時長和更兼容的電極組織界面。而植入式神經電極只能對檢測位點周圍50 μm范圍內的神經元進行記錄，這就需要增加電極的記錄位點和密度，減小植入電極的尺寸，提高電極位點的生物相容性。微納米加工技術為柔性神經電極的發展提供了新的解決方案，此外，信號的低噪聲放大、多路復用和無線傳輸等信號讀出技術的發展也將進一步推動植入式柔性神經電極的高密度和高通量集成。

柔性神經電極為高性能神經假體的發展提供了良好的技術手段，但是，現在用于柔性神經電極的動物模型多為嚙齒類動物，較少用于靈長類動物。因此，需要將柔性神經電極技術拓展至靈長類動物的臨床研究。靈長類動物的記錄和刺激需要將柔性神經電極植入大腦的深部腦區，植入深度將達到幾厘米。要達到上述目標，需要融合材料、電子、微加工、力學和神經科學等多學科的研究。另外，柔性電子還需與新的檢測方法聯用，如光學成像技術、化學傳感技術、核磁共振成像技術和納米技術等，集成的多功能系統將有助于腦電信號的檢測和腦功能的研究。

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Implantable and Flexible Electronics for

in Vivo Brain Activity Recordings

WANG Jin?Fen 1，2，5， TIAN Hui?Hui1，2， FANG Ying*1，2，3，4

1（CAS Center for Excellence in Nanoscience， National Center for Nanoscience and Technology， Beijing 100190， China）

2（CAS Key Laboratory for Biomedical Effects of Nanomaterials and Nanosafety，

National Center for Nanoscience and Technology， Beijing 100190， China）

3（University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

4（CAS Center for Excellence in Brain Science and Intelligence Technology，

Chinese Academy of Sciences， Shanghai 200031， China）

5（State Key Laboratories of Transducer Technology， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100190， China）

Abstract?Implantable electronics are essential for electrophysiological recording at single?neuron and sub?millisecond resolution in the fields of neuroscience and neuroprosthesis. Advances in nano/microfabrication techniques offer new and exciting opportunities for the development of high?density implantable electronics. However， the mechanical mismatch between microfabricated rigid electronics and soft brain tissues has been shown to cause inflammatory responses， leading to signal degradation during chronic recording. Recently， flexible electronics with improved mechanical compatibility to brain tissues have been intensively investigated to improve the performance of chronic neural recordings. Flexible electronics can form conformal interfaces with brain tissue， resulting in minimized inflammatory responses and stable signal recordings. In addition， ultra?small， high?density， and multiple?functionality are also desirable features of flexible neural electronics. In this review， we highlight recent progress in microfabricated flexible electronics for in vivo brain activity recordings， with a focus on structural design， brain/tissue interface， implantation method， minimization and multifunctional integration.

Keywords?Flexible electronics; Implantable electronics; Immune reactivity; Electrophysiological recording; In vivo; Review