神經電調控 雙模信號檢測系統與活體大鼠腦深部核團實驗驗證

張禹　徐聲偉　何恩慧　肖桂花　宋軼琳　高飛　王蜜霞　蔡新霞

摘?要?深腦核團電刺激（DBS）已成為改善帕金森病人運動障礙的有效治療手段，然而其確切的治療機制仍然不明。目前， DBS機制探究系統多由電刺激儀器和信號檢測儀器兩部分構成，多臺實驗設備的長期開啟易產生操作程序復雜、環境噪聲增多和資源浪費等問題。本研究建立了一套綜合性實驗系統，包括將電刺激功能與神經雙模信號檢測功能集成的神經電調控?雙模信號檢測儀器和基于微機電加工技術制備的微電極陣列（MEA）。在體實驗前，對經納米鉑黑和Nafion膜修飾的MEA進行體外標定。實驗結果表明，1～50 μmol/L多巴胺（DA）溶液與修飾后的電極表面氧化電流值呈良好的線性關系，線性相關系數為0.998。隨后，設計并進行了以前腦內側束為電刺激靶點，紋狀體為神經信息檢測核團的活體大鼠實驗。實驗結果表明，紋狀體內DA濃度在刺激后迅速上升，最高達2.06 μmol/L， 約為刺激前水平的1.57倍;神經元動作電位發放率增加，由刺激前的1.17 Hz上升至6.77 Hz;場電位活動增強，功率由刺激前的0.19 mW上升至0.64 mW。本研究設計并制備的神經電調控?雙模信號檢測系統實現了電刺激與雙模信號檢測的功能集成，有望為DBS治療機制的探究提供有效實驗工具。

關鍵詞?深腦核團電刺激; 微電極陣列; 多巴胺; 神經電生理信號; 神經遞質

1?引 言

帕金森疾病是一種影響全世界數百萬人的神經退行性疾病，主要的病理變化為紋狀體內多巴胺（DA）濃度的明顯減少和黑質致密部多巴胺能神經元的變性缺失[1～3]，導致患者出現運動遲緩、肌肉僵直和靜止性震顫等運動癥狀，以及嗅覺障礙、睡眠障礙和抑郁等非運動癥狀[4，5]。20世紀90年代以來，深腦核團電刺激（DBS）被認為是減輕帕金森疾病中藥物難治性運動癥狀的有效治療手段[6～8]，通過對腦內特定神經核團施加一定參數的電脈沖，達到減輕病態癥狀的效果。為探究DBS的治療機制，研究者多采用包括電刺激器和單模信號檢測儀器在內的兩套獨立儀器[9，10]，多臺實驗設備的長期開啟易造成操作步驟繁瑣、環境噪聲增多和資源浪費等問題，不利于腦內微弱信號的測量。

前腦內側束（MFB）作為黑質?紋狀體通路中重要的神經核團，被認為是基底節回路中有效的電刺激靶點之一[11]。研究者通過碳纖維電極探測的方法發現，經MFB?DBS后，紋狀體內DA濃度有所升高[12]，但由于缺少對神經電生理信號的同步記錄，紋狀體內神經元在刺激前后神經信息的綜合性變化未得到直觀描述。

為解決上述問題，在前期工作的基礎上[13，14]，本研究設計并建立了一套綜合性實驗系統，包括將電刺激功能和神經雙模信號檢測功能集成的神經電調控?雙模信號檢測儀器和經納米材料修飾的微電極陣列（MEA）生物傳感器?；诖讼到y開展活體動物實驗，通過向大鼠MFB施加電刺激，同步觀察紋狀體內DA的濃度變化和神經元的放電情況。

2?實驗部分

2.1?神經電調控?雙模信號檢測儀器

本研究基于 LabVIEW 虛擬儀器開發平臺，在實驗室原有的雙模信號檢測系統[15，16]的工作基礎上，設計并制備了集成電刺激功能和神經雙模信號檢測功能于一體的神經電調控?雙模信號檢測儀器（圖1）。

2.1.1?儀器電源部分?此儀器采用15 V統一單向供電。電刺激部分利用高壓直流電源變換為低壓直流電源模塊（DCDC）和低壓差線性穩壓器（LDO）將15 V單向電源轉換為±12 V雙向供電。電生理檢測部分和電化學檢測部分利用DCDC和LDO將15 V單向供電值轉換為±5 V雙向供電。

2.1.2?電刺激部分?本系統設計的電刺激模塊提供矩形波、正弦波、三角波和用戶自定義方波等基本刺激圖形，供用戶選擇，用戶可通過上位機軟件對所選波形進行參數編輯（脈沖幅值、脈沖寬度、正負脈沖間隔和脈沖數量），確定后的刺激波形由采集卡的模擬信號輸出口輸出。當用戶選擇電壓信號刺激時，采集卡的輸出將經過一個電壓跟隨器輸出至刺激電極; 當用戶選擇電流信號刺激時，采集卡輸出的電壓將經過一個電壓?電流轉換電路再輸出至刺激靶點。數據采集卡采用美國 NI 公司的USB6255 OEM，具有2個模擬信號輸出口。

2.1.3?神經信息檢測部分?神經信息檢測部分包括4通道的神經電化學信號檢測模塊和64通道的神經電生理信號檢測模塊。神經電化學信號檢測方面，以包括工作電極、對電極和參比電極在內的三電極體系作為設計基礎。利用采集卡的模擬信號輸出功能，實現工作電極上氧化/還原電位的施加; 利用電流?電壓轉換放大電路和采集卡模擬信號采集功能，將神經遞質反應所引起的電流變化轉換為電壓信號，并放大至mV級被采集卡采回。神經電生理信號檢測方面，由于神經電生理信號為μV級的微弱信號，過長的傳輸距離易使信號發生畸變、失真。因此，在信號進入主放大濾波電路前，首先在傳感器的末端接入放大倍數為10的前置放大器，進行信號的第一次放大，隨后利用漆包線將信號傳至主放大濾波電路，再進行100倍的第二次放大，最終不易受環境影響的mV級電壓信號被采集卡的模擬信號采集端口采回。

2.2?其它儀器與試劑

KH2200E 超聲振蕩器（中國合創公司）; ?BX51TRF光學顯微鏡（日本Olympus 公司）; S?800 掃描電鏡（日本 Hitachi 公司）; 腦立體定位儀（美國Stoelting公司）; 50?12?1C液壓探針驅動器（美國FHC公司）; MW?D20 實驗室超純水器（中國美誠公司）; 雙極型同心圓電刺激電極（美國Microprobes公司）; 128 通道模擬神經信號發生器（Blackrock 公司）。

0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS， Na2HPO4NaH2PO4KCl， pH 7.4，美國Sigma公司）; 多巴胺（DA）、二羥基苯乙酸（DOPAC），谷氨酸（Glu）和抗壞血酸（AA）（美國Alfa Aesar公司）; 氯鉑酸（H2PtCl6）和醋酸鉛（Pb （CH3COO）2）（中國國藥化學試劑）; 生理鹽水（中國雙鶴制藥公司）; Nafion陽離子交換膜（美國Sigma公司）。實驗用水為去離子水。整個實驗過程在室溫下進行。

2.3?微電極陣列的制備

所使用的16通道微電極陣列[15]是基于微機電加工工藝技術，以硅片為基底，以鉑（厚度250 nm）為導電層，以氧化硅（厚度300 nm）和氮化硅（厚度500 nm）為雙絕緣層進行制備。在體實驗前，為降低電極位點的阻抗值，將納米材料修飾在電極表面。 2 mmol/L H2PtCl6和2 mmol/L Pb（CH3COO）2按體積比1∶1混合后作為電鍍液，MEA為工作電極，Pt為對電極，采用兩電極體系的計時電流法（?1 V，50 s）電鍍納米鉑黑。其中，Pb2+的加入更有利于生成大量的、小尺寸鉑黑納米粒子[16～18]。為提高MEA對DA的選擇性，將Nafion膜涂覆在位點表面，并通過100℃的紅外探照燈加熱30 min將其烘干。

2.4?實驗方法

2.4.1?神經電調控?雙模信號檢測儀器的性能測試?為驗證神經電調控?雙模信號檢測儀器的功能可行性，利用電刺激模塊向外施加雙向矩形波電刺激（100 Hz，200 μA，1 s）; 通過信號發生器的輸出模擬神經電生理信號; 通過在100 MΩ金屬膜電阻兩端施加+0.5 V電位模擬神經遞質的反應電流，以此觀察儀器的電刺激輸出情況和雙模信號檢測情況。對于采集卡采回的結果，一方面，將刺激輸出的實際電壓值與上位機軟件設置的電壓值進行比較，證明電刺激輸出的準確性; 另一方面，通過觀察電刺激施加前后神經信號檢測模塊檢測到的信號幅值變化，探究電刺激模塊與檢測模塊的串擾情況。

2.4.2?微電極陣列的基本性能測試

在體實驗前，使用以MEA為工作電極、Ag|AgCl為參比電極，Pt為對電極所構成的三電極體系探究DA濃度與電極表面氧化電流之間的關系。具體地，氧化電壓值設置為+0.5 V，1～50 μmol/L DA溶液依次滴加至PBS中，觀察電極表面氧化電流值的變化。

為探究MEA的抗干擾性能，參考紋狀體內各個神經遞質的濃度[19～22]，100 μmol/L UA、30 μmol/L DOPAC、1 μmol/L Glu和300 μmol/L AA被依次滴加至PBS中，觀察電極位點的氧化電流值變化。

2.4.3?電刺激下的雙模檢測實驗?為驗證系統的可行性及探究電刺激下紋狀體內神經元的活動變化，本研究基于神經電調控?雙模信號檢測系統，設計了以MFB為刺激靶點，以紋狀體為檢測靶點的DBS實驗。選取200～300 g健康雄性大鼠，經20%烏來糖（0.7 ml/100 g）麻醉后進行開顱手術。電推進器以每隔5 min下降500 μm的速度將電刺激電極植入至前腦內側束（AP： 1.92 mm， ML： 2.2 mm，DV：8.4 mm）， 到達目標區域后，利用牙科水泥將其固定; 將微電極陣列以10 μm/s的速度植入至紋狀體（AP： 1.08 mm， ML： 2.8 mm，DV： 4～5 mm），其中8個通道作為神經電生理信號檢測通道，1個通道作為神經遞質DA的檢測通道。Ag|AgCl參比電極和顱骨釘的位置分別為AP： 1.92 mm， ML： 2.2 mm和AP： 6.72 mm， ML： 2.8 mm。植入電極后，待大鼠狀態穩定，將多巴胺氧化電壓值設置為+0.5 V，進行電刺激下的紋狀體內神經信息記錄。其中，電刺激參數設置為雙向方波，刺激頻率100 Hz， 刺激幅值200 μA， 刺激脈沖數100 plus，持續時間為1 s。

3?結果與討論

3.1?神經電調控?雙模信號檢測系統的性能測試在電刺激方面，對比上位機設置的電流值，儀器輸出的電流值準確度>96%。在電生理信號采集方面，電壓信號能夠被成功地采回至采集卡，并且進行顯示與保存; 當電刺激輸出時，刺激前后信號基線無明顯變化（圖2A）; 在電化學信號采集方面，準確的電流值被采集卡實時采回，在上位機顯示; 刺激前后電化學信號電流基線無明顯變化（圖2B）。此實驗驗證了電刺激模塊、電生理信號檢測模塊和電化學信號檢測模塊都能夠很好地工作，并且相互之間沒有產生明顯干擾。

3.2?微電極陣列的基本性能

與裸電極相比（圖3A），修飾后的位點集聚了大量的納米鉑黑顆粒（圖3B），極大地增加了電極與神經元的接觸面積。電極體外標定結果表明，1～50 μmol/L DA溶液與電極表面氧化電流值呈良好的線性關系，線性相關系數為0.998，對應斜率為12.254 pA/μmol/L（圖4A和圖4B）。干擾物測試結果表明，修飾后的電極對UA、DOPAC和Glu幾乎無響應，對AA的響應為9 pA（圖4C）。因此，干擾物對DA測量的影響很小。

3.3?電調控下紋狀體內神經信號檢測結果

活體動物實驗結果如圖5所示。MFB?DBS后，DA濃度迅速升高，最高達2.06 μmol/L，約為刺激前水平的1.57倍。與此同時，神經元發放活動和場電位波動情況明顯增多。經過主成分分析和聚類分析得到的動作電位波形如圖6A所示，峰值范圍為128.44～807.34 μV， 且具有較長的復極化時間（2.1 ms）。神經元的發放率由穩定狀態的1.17 Hz上升至6.77 Hz， 相比于未刺激之前增加約5.7倍（圖6B）。相似地，代表細胞群體特征的場電位信號，

在受到刺激后，高頻活動得到明顯提升（圖6C），場電位活動功率由刺激前的0.19 mW上升至0.64 mW（圖6D）。

4?結 論

設計并建立了一套神經電調控?雙模信號檢測系統，實現了電刺激施加、神經電化學信號檢測和神經電生理信號檢測的功能集成。實驗結果表明，儀器內部的刺激模塊與檢測模塊能夠有效地工作，相互之間未造成明顯的信號干擾?；诖讼到y開展的體外標定實驗表明，修飾后的微電極陣列對于1～50 μmol/L濃度范圍內的多巴胺溶液具有良好的氧化電流響應; 對于UA、DOPAC、Glu、AA等常見干擾物的響應極低。通過設計MFB?DBS大鼠實驗，不僅驗證了整個系統可良好地應用于活體動物實驗，而且說明了MFB?DBS具有提高紋狀體內多巴胺濃度和促進神經元興奮性發放的作用。

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Neural Electrostimulation?Detection System and

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ZHANG Yu1，2， ?XU Sheng?Wei1，2， ?HE En?Hui1，2， ?XIAO Gui?Hua1，2，

SONG Yi?Lin1，2， ?GAO Fei1，2， ?WANG Mi?Xia1，2， ?CAI Xin?Xia1，2

1（State Key Laboratory of Transducer Technology， ?Institute of Electronics，

Chinese Academy of Sciences， ?Beijing 100190， ?China）

2（University of Chinese Academy of Sciences， ?Beijing 100049， ?China）

Abstract?Although deep brain stimulation （DBS） has become an effective treatment for improving dyskinesia in Parkinson's disease， ?the exact treatment mechanism remains unclear. In addition， ?the current system researching DBS mechanism is always composed of two individual parts： the electrical stimulation instrument and the signal detection instrument， ?which makes it easy to cause the complicated operation of procedure and the waste of resource. In this work， ?a comprehensive experimental system was established， ?including an electrostimulation?detection instrument which integrated the function of electrical stimulation and neural signal detection， ?and the microelectrode arrays （MEA） which were fabricated by micro?electro?mechanical system （MEMS） and modified by nanoplatinum and nafion membrane. Experimental results showed that dopamine in concentration range of 1-50 μmol/L had a good linear relationship with the surface oxidation current of the modified MEA， ?and the linear correlation coefficient was 0.998. What's more， ?DBS was designed with the medial forebrain bundle （MFB） as stimulation target and the striatum as detection area， ?which made the striatal simultaneous observation of dopamine concentration and neuronal firing was achieved while electrical stimulation was applied. Experimental results indicated that the concentration of dopamine in the striatum increased rapidly after stimulation， ?reaching a maximum of 2.06 μmol/L which was about 1.57 times of the pre?stimulation level; the spike firing rate increased from 1.17 Hz to 6.77 Hz; and the power of local field potential was enhanced from 0.19 mW to 0.64 mW. The electrostimulation?detection system developed in this study realized the integration of electrical stimulation and dual?mode signal detection， ?which simplified the complex experimental steps and was expected to provide an effective experimental tool for the exploration of DBS treatment mechanism.

Keywords?Deep brain stimulation; Microelectrode arrays; Dopamine; Neuro?electrophysiological signal; Neurotransmitters