活體微電極抗蛋白質吸附的研究進展

馮濤濤　張帥　張麗　張美寧

摘?要?活體電化學分析方法是利用微電極植入特定腦區原位監測腦內神經化學物質動態變化的方法之一，具有高時空分辨率、高靈敏度、對腦組織損傷小等優點。然而，微電極的植入會引發機體產生一系列的排異反應，這將對微電極的電分析性能產生不利影響。一方面，蛋白質的非特異性吸附會導致微電極的靈敏度和選擇性下降;另一方面，蛋白質介導的細胞粘附，其代謝過程會導致電極周圍的微化學環境改變，從而影響微電極對神經化學物質檢測的準確性。最終，電極表面上形成的纖維囊會阻礙電子（電荷）的轉移，導致微電極無法正常工作。本文首先簡要介紹了蛋白質非特異性吸附對電極電化學性能的影響，以及近年來發展的電極抗蛋白質吸附的方法和策略，對活體原位電化學分析中抗蛋白質吸附的研究進展做評綜述，并對活體微電極抗蛋白質吸附存在的問題及未來的發展進行了總結和展望。

關鍵詞?活體分析; 微電極; 蛋白質吸附; 抗蛋白質吸附; 評述

1?引 言

腦是生命體中精密又復雜的系統，通常神經元的集體行為會產生大腦功能的變化，神經元之間信息的傳遞本質上是神經遞質在神經元突觸間的傳遞[1，2]。了解神經元所處的微化學環境以及信息傳遞中的分子機制對深刻理解大腦功能具有十分重要的意義; 對許多中樞神經系統（CNS）疾病，如多發性硬化（MS）、阿茲海默癥（AD）和癲癇的治療及預防具有重要指導意義。神經化學物質主要包括：神經元信息傳遞中起著重要作用的遞質，如單胺類遞質（多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素等），氨基酸類遞質（谷氨酸、氨基丁酸等），神經調質（抗壞血酸等），離子（H+、K+、Zn2+、Ca2+、Mg2+等），活性氧自由基（H2O2、O

2等），能量代謝物質（葡萄糖、ATP等），氨基酸，脂質，多肽，磷脂，蛋白質，核酸（DNA和RNA）和參與神經活動的其它的化學物質（乙酰膽堿、神經肽等）。因此，實時監測腦內神經化學物質的動態變化，對于更好地認識與腦相關的生理及病理學過程具有重要的意義[3～6]。

活體原位電化學分析方法是將微電極植入特定腦區原位監測神經化學物質動態變化的方法[7～9]，該方法因具有高時空分辨率、高靈敏度和對腦組織損傷小等優勢，受到越來越多的關注[10～16]。但腦環境較為復雜， 不僅存在許多小分子物質，而且還包含許多生物大分子。當微電極植入到腦組織時，生物大分子（特別是蛋白質）會迅速地吸附在微電極表面（此過程被認為是生物污染的第一步）。吸附的蛋白質會覆蓋電極表面部分活性位點， 阻止物質傳輸和電子（電荷）轉移，最終導致微電極的靈敏度和選擇性降低[17，18]。此外，微電極將不可避免地導致一系列不良的生物反應，如細胞黏附、血小板活化、血栓形成以及補體激活[19，20]。這些過程將會導致電極周圍化學環境的改變，從而影響微電極對神經化學物質檢測的準確性。此外，形成的纖維囊會完全阻礙電極表面上的電子轉移和物質傳輸，從而導致微電極無法正常工作（圖1）。因此，抑制蛋白質的非特異性吸附在一定程度上可防止電極表面生物污染。本文將簡單地介紹蛋白質吸附對電極性能的影響，及電化學中抗蛋白質吸附的方法策略，并詳細綜述活體原位電化學分析中抗蛋白質吸附研究的進展。

2?蛋白質吸附對電化學性能的影響

在電化學傳感器的研究中，不僅需要研究蛋白質在電極表面的非特異性吸附，最重要的是研究蛋白質吸附對電極電化學性能的影響。一般認為吸附在電極表面的蛋白質層是一個惰性的、非電化學活性的阻礙層， 會影響電極的電化學性能，如法拉第電流、雙電層電容（Cd1）、電極阻抗，從而影響電極對待測物的電化學檢測結果，而且，這種影響隨著電極表面蛋白質的覆蓋率增大而加劇[21～23]，影響最大的是電極的法拉第電流。因在任何情況下，電極表面發生蛋白質的非特異性吸附時，電極表面和電解質之間的電子（電荷）轉移速率都會受到嚴重阻礙，探針（或待測物）擴散到電極表面發生氧化還原反應也會被阻礙或完全阻止。

蛋白質吸附會影響電極/電解質界面處靠近電極表面緊密層的結構，從而導致電極雙電層結構（雙電層電容）的改變。研究表明：將電極暴露于蛋白質溶液中， 會導致電極/電解質界面處的電子（電荷）轉移電阻（Rct）增加以及電極的Cd1減小。Rct的增加將會導致探針（或待測物）的氧化/還原電位分別正移或者負移（ΔEp增加）。此外，Cd1的改變受到各種檢測條件的影響[24，25]，例如， 當吸附發生在電極開路電位或更高電位時，電極的最大電容更大程度的減小; 在相同條件下，與吸附的血清白蛋白相比，免疫球蛋白G（Ig.G）的吸附會導致Cd1減小的更多（圖2）。也有研究表明，吸附的蛋白質導致電極Cd1的變化通常約為裸電極的10%，一般電化學檢測技術（如計時電流法或微分脈沖伏安法）可不考慮，因已經扣除了背景充電電流，或者充電電流相對于法拉第電流衰減的較快[25]。

3?電極抗蛋白質吸附的策略

蛋白質的非特異性吸附過程非常復雜，一般認為是由于蛋白質和電極表面強的相互作用引起的。這種相互作用主要包括靜電吸引/排斥相互作用、疏水/親水相互作用、氫鍵和偶極相互作用。研究表明：吸附過程一般不是由單一的某種相互作用決定的，而是由這些相互作用協同完成的。由于在水體系中，蛋白質吸附時其疏水相互作用的強度更大[26～28]，所以許多減少表面蛋白質非特異性吸附的主要策略是增加電極表面的親水性。近年來，研究人員使用一系列抗蛋白質吸附的方法和策略，如調控特殊的電極表面形貌和使用涂層修飾電極表面等方法[29～31]，旨在減少蛋白質在電極表面的非特異性吸附，從而提高電極對待檢測物檢測結果的準確性和可靠性。

3.1?構筑特殊結構的電極表面

目前，特殊表面形貌的構筑主要集中在多孔電極的制備，因多孔結構能夠增加電極的孔隙率和表面積、暴露更多的電化學活性位點、以及阻止蛋白質到達孔電極內表面，從而降低蛋白質吸附對電極靈敏度造成的不利影響[32～34]。Collinson研究組[35]制備了不同大小孔徑的金電極，分別使用鐵氰化鉀、六氨合釕、二茂鐵甲醇作為電化學探針， 研究了不同孔徑對蛋白質非特異性吸附的影響。他們發現具有納米孔的金電極在2 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）溶液中浸泡1 h后，電極的靈敏度未發生明顯變化。相比之下，金盤電極、大孔和分級孔的金電極的電流響應大幅度降低（圖3A）。納米孔電極提高抗蛋白質吸附性能主要是因蛋白質能夠吸附到納米孔金電極表面，但無法擴散到孔結構的內表面，但分子量較小的探針可擴散到納米孔結構的內表面而發生氧化還原反應，從而在宏觀上減少蛋白質吸附對納米多孔金電極電化學性能的不利影響。該研究組[36]通過脫合金方法制備了抗蛋白質吸附的納米多孔金電極，在BSA存在的情況下，實現了對抗壞血酸（AA）和尿酸（UA）的同時檢測。 Daggumati等[37]用DNA探針修飾納米多孔金電極，在胎牛血清（FBS）和BSA存在的情況下檢測了DNA分子，他們發現蛋白質的吸附導致檢測信號僅降低了5%，表明納米孔電極能有效提高抗蛋白質吸附的性能。

4?活體電化學抗蛋白質吸附

腦是一個復雜的系統，不僅有神經細胞、膠質細胞、小分子，還有生物大分子等，如蛋白質。在活體伏安法分析中，當微電極被植入到活體腦組織中時，電極會引發一系列的排異反應，從而影響電極的電化學分析性能[67]。首先，在電極植入到活體的短時間內，蛋白質會非特異性吸附到電極表面，從而使電極的靈敏度迅速下降， 響應時間變長。其次，在蛋白質吸附之后的幾天內，中性粒細胞的吸附占據主導地位，在24～48 h 后，中性粒細胞逐漸消失，并被單核細胞及巨噬細胞取代，最終在電極周圍形成由巨噬細胞和膠原蛋白組成的無血管纖維囊（50～200 μm），以致使物質的傳輸和電子轉移受阻，最終導致電極靈敏度下降，甚至使電極失去響應[68，69]。因此，避免蛋白質在電極表面的非特異性吸附（即抗生物污染），同時提高微電極的電化學性能對活體電化學的研究至關重要。

蛋白質吸附導致的一個結果是微電極必須在植入活體后進行校正， 通常認為電極在植入到腦內一段時間后蛋白質吸附會達到穩定，所以選擇在活體實驗后進行電極校正，進而分析活體檢測信號[70，71]。但，活體后校正方法仍存在一些問題。首先，活體分析中使用的碳纖維電極比較脆，從腦中取出時很容易折斷而無法進行后校正實驗。其次，后校正方法的提出是基于在整個實驗過程中電極的靈敏度保持不變，這就要求我們的電極在植入活體后，蛋白質能夠迅速吸附并達到平衡。但， 腦內蛋白質環境復雜，且蛋白質濃度在不同的生理和病理環境下可能發生變化。如干擾素和血小板衍生生長因子等在疾病中濃度會發生變化[72]，這使得后校正方法對獲取比較真實的活體檢測信號存在一些偏差。

為了解決蛋白質吸附所造成的活體微電極的校準問題，研究人員提出了一些新的策略。Roberts等[73]基于快速掃描伏安法（FSCV）建立了電極的原位校正方法，該方法借助電極背景中的非法拉第電流等參數建立模型，通過理論預測對電極進行校正。但該方法僅局限于FSCV，并且影響模型參數的因素較多，不同的實驗室在使用時均需要重新測量參數?？刮鄄牧闲揎楇姌O表面以減小蛋白質的非特異性吸附是解決電極靈敏度降低、活體后需要再次校正的另一策略。目前，Nafion，堿處理的醋酸纖維，PEDOT/Nafion等材料在一定程度上可減少蛋白質的非特異性吸附[44～48]。 Singh等[48]系統的研究了Nafion、 醋酸纖維、 牽連蛋白修飾碳纖維電極（CFE）對單胺類遞質檢測結果的影響。他們發現不同材料修飾電極對電極的靈敏度、 選擇性及抗污染性能的影響也不同。有些材料有助于提高電極的選擇性和靈敏度（如Nafion），有些材料則能提高電極的抗污染性能（如醋酸纖維、牽連蛋白）。雖然這些材料可通過控制厚度來提高電極的抗污染性能，但電極在活體實驗后靈敏度仍然有較大的變化，仍需對電極進行活體后的校正。

為了克服微電極必須在活體后校準的缺點，Liu等[10]提出了用BSA處理微電極的方法進行活體原位分析，因他們發現微電極在BSA溶液中，電極的靈敏度會迅速降低，但BSA的濃度大于30 mg/mL時，電極的靈敏度不再下降， 即使電極在與BSA電荷相反的蛋白質溶液中，電流響應也很穩定。基于此，他們在活體檢測前用40 mg/mL BSA處理微電極，結果表明，活體前校準曲線的靈敏度和活體后校準曲線的靈敏度一致。 并且， 用BSA處理檢測多巴胺（DA）的CFE和檢測抗壞血酸（AA）的碳納米管修飾CFE，發現這兩種電極在活體前和活體后的校準曲線都是一致的， 這說明了BSA處理的方法具有很好的普適性。該方法為活體電化學方法提供了可靠且簡單的電極前校準的策略（圖6）。

在提高微電極的抗蛋白吸附能力的同時保持微電極的靈敏度對活體檢測極其重要，Liu等[17]進一步設計了聚合物單體EDOT?PC（兩性離子磷酸膽堿官能化的乙烯二氧噻吩），并通過電化學聚合法將其可控地聚合在微電極表面，形成了具有類細胞膜結構的PEDOT?PC超薄膜。其中由于PC端的電化學聚合自限制，形成了非常薄的PEDOT?PC膜，保證了待檢測物在膜內的快速傳質。因此，PEDOT?PC修飾的微電極不僅能夠有效地抗蛋白質的非特異性吸附，而且能保持電極的檢測靈敏度。利用PEDOT?PC修飾的CFE準確監測了大鼠腦內KCl刺激，以及電刺激過程中DA的釋放。該研究有效解決了微電極在活體原位分析中蛋白質吸附的關鍵問題，為更好地研究腦神經化學的分子機制奠定了重要基礎（圖7）。

在微電極的表面構筑特殊結構也是有效克服蛋白質吸附造成分析性能下降的有效途徑。Zhou等[18]在CFE表面構筑了一個高孔隙率的、有序的二氧化硅抗污染薄膜（SNM）。SNM能夠有效地防止蛋白質進入到通道中引起CFE電極表面的生物污染，同時對O2的擴散具有高滲透性。活體實驗表明：SNM/CFE可連續監測O2且能夠保持對其高的分析靈敏度和快速響應。為了能夠在構筑多孔結構的同時又具有高的親水性能，Feng等[74]報道了一種聚單寧酸（PTA）摻雜的納米多孔導電聚苯胺（PANI）膜涂層，其中PANI構筑了多孔的結構，PTA的摻雜不僅使得PANI在中性溶液中保持了導電能力，而且PTA的多羥基使得構筑的PTA?PANI多孔膜親水性能更強，并對DA具有很強的富集能力。所制備的PTA?PANI修飾的CFE表現出高的抗蛋白吸附的能力，活體前和活體后DA的校準曲線靈敏度基本一致，并且活體檢測DA的釋放具有高的穩定性（圖8）。

在電化學分析中，蛋白質吸附對不同信號輸出方式的影響不同，因此所使用的抗蛋白質吸附的方法也不同。Hao等[75]發展了一種具有高抗蛋白質吸附性能的電位型傳感器可用于直接監測鼠腦中pH的變化。該電極通過使用H+選擇性膜（H+ISM）和含有增塑劑雙（2?乙基己基）癸二酸酯，H+離子載體三癸胺和離子交換劑鉀四（4?氯苯基）的聚氯乙烯聚合物基質制備。體外和體內研究均表明，CF?H+ISEs電極具有很強的抗蛋白質吸附性能，CF?H+ISE能夠在活體檢測后保持和活體前相同的靈敏度和可逆性（圖9）。

此外，使用紅細胞膜修飾Ag/AgCl設計的參比電極也表現出優異的抗蛋白質吸附的性能[76]，在活體內能提供穩定的電位并減小對組織的損傷。

5?結 論

在活體電化學分析中，微電極抗蛋白質吸附層的設計對提高活體檢測結果的準確度，以及正確理解大腦功能的分子機制，都具有十分重要的意義。雖然在宏觀電極上，目前有很多抗污染的方法可實現抗蛋白質的吸附，并能實現部分復雜樣品，如血液等中的物質的分析，活體內通過電極界面設計也實現了部分物質的短時間實時分析，但活體分析抗蛋白質的吸附仍然存在很大的挑戰。這主要是因為：（1）在宏觀電極上可實現的策略，很難在微電極上實現，如表面微結構的調控，表面修飾等，因微電極表面需要更苛刻的合成條件和原位可控修飾技術; （2）抗蛋白質吸附策略物質依賴性強，不同信號讀出方式，信號轉換方式的抗蛋白質吸附策略也不一樣，需依據不同信號讀出方式（如電流法、電位法、電阻法等）和不同轉換方式（如酶、適配體等）設計不同的抗蛋白質吸附的策略[77～80]; （3）活體長期檢測需要抗蛋白質膜具有更高的生物相容性和化學穩定性。相信，隨著各學科的發展，如材料科學、微納制備技術、信號轉換和讀出模式等，能更好地解決微電極的蛋白質吸附的問題，實現腦內化學物質的準確分析，更好地揭示腦神經科學的化學本質。

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Recent Advances on Antifouling of Microelectrode

for in Vivo Electrochemistry

FENG Tao?Tao， ?ZHANG Shuai， ?ZHANG Li， ?ZHANG Mei?Ning*

（Department of Chemistry， ?Renmin University of China， ?Beijing 100872， ?China）

Abstract?In vivo electrochemistry is one of the attractive approaches for tracking of the dynamic of neurochemicals in the brain. Carbon fiber electrodes （CFE） are usually implanted in specific brain regions for monitoring neurochemicals due to its high spatial and temporal resolution， ?high sensitivity and small brain tissue damage. However， ?the implantation of CFE can trigger a series of negative effects for in vivo analysis. On the one hand， ?protein nonspecific adsorption causes the decrease in electrodes sensitivity. On the other hand， ?protein?mediated cell adhesion on microelectrode surface can lead to microchemical environment changes around the microelectrode， ?which affects the accuracy and reliability of the detection results toward neurochemicals. In addition， ?the resulting fibrous capsule blocks electron transfer between electrode surface and electrolyte， ?resulting in failure in terms of sensing. In this paper， ?we briefly introduced the effect of protein adsorption on the electrochemical performance and reviewed the recent advances on antifouling of microelectrode for in vivo electrochemistry.

Keywords?In vivo electrochemistry; ?Microelectrode; ?Protein nonspecific adsorption; ?Antifouling; ?Review