豬傳染性胃腸炎診斷技術研究進展

孫偉　劉杉杉　周佳　黃雪飛　吳強

摘要：豬傳染性胃腸炎在全世界范圍內暴發，臨床癥狀主要以仔豬腹瀉、嘔吐和脫水為主，嚴重者可導致死亡，給生豬養殖造成了巨大的經濟損失。隨著混合感染加劇，特別是與TGE類似病癥的傳染病的出現，單純依靠臨床觀察和病理變化，很難對該病做出準確診斷，因此需要借助于免疫學和分子生物學檢測技術。本文就免疫學和分子生物學技術在TGE診斷中的最新應用情況進行綜述，以期為TGE的防控提供一定的科學參考。

關鍵詞：豬傳染性胃腸炎;免疫學;分子生物學;診斷技術;研究進展

豬傳染性胃腸炎（transmissible gastroenteritis，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）感染引起的一種高度接觸性烈性傳染病。TGEV與豬群高發病率密切相關，臨床癥狀主要以腹瀉、嘔吐和脫水為主。不同年齡和品種的豬群均易感，其中2周齡以內仔豬感染TGEV后，可出現嚴重腹瀉，病死率高達100%[1]。1933年美國首次出現TGE，并在1946年由Doyle和Hutchingd首次分離并鑒定第一株TGEV[2]。隨后，TGE相繼出現在日本、英國等歐洲、北美洲和亞洲等多個國家和地區。我國自上世紀60年代首次發病以來，TGE不斷在我國大部分地區流行，并呈現逐年上升的趨勢。TGEV給全世界的養豬業造成了巨大的經濟損失。本文就TGE的診斷技術和研究現狀做如下綜述，以期為TGE的有效預防和研究提供科學參考。

1病原特征

TGEV是一種有囊膜的、單股正鏈RNA病毒，分類學上屬于冠狀病毒科a冠狀病毒屬成員。病毒粒子呈圓形或橢圓形，直徑約為100_150nm[3]。TGEV基因組全長28.6kb，共編碼4種結構蛋白和3種非結構蛋白[4]。

TGEV對外界的抵抗力較強，20℃存放2周或是35℃存放24h，仍具有感染性。糞尿和腸道組織中的病毒粒子，在低溫下保存數月，滴度仍無明顯改變。但TGEV對光和紫外線敏感，經照射后很快失活。乙醚、氯仿、甲醛、去氧膽酸鈉等有機溶劑作用后很快失活。

2診斷技術研究

TGE是一種高度接觸性傳染病，易和豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PED）、豬A群輪狀病毒（porcine A group rotavirus，PGAR）混合感染，且三者臨床癥狀、傳播途徑類似，很難區分。因此，快速診斷對于TGE的有效防控具有十分重要的意義。然而，目前很難對TGE做出臨床確診，仍需要借助于分子生物學或是免疫學方法，才能做出最終的鑒別診斷。

2.1免疫學診斷技術

2.1.1酶聯免疫吸附測定

酶聯免疫吸附測定（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測方法敏感性高、特異性強，且操作簡單，可同時對大量樣本進行病原和血清抗體檢測。宋振輝等[5]通過原核系統表達的TGEV衣殼蛋白為抗原，建立了一種檢測TGE的間接ELISA方法，相比于商品化的抗體檢測試劑盒，特異性、敏感性和符合率分別達到了93.8%、93.5%和93.5%。屈月等[6]在此基礎上進行了改進，建立了由TGEVN蛋白單克隆抗體和多克隆抗體構成的夾心ELISA方法。結果表明，該方法具有良好的重復性，與其他病原體無交叉反應。同樣，原核表達TGEVS基因主要的抗原位點序列，并通過該重組蛋白建立的間接ELISA方法與TGEV包被的ELISA方法相比較，檢測結果符合率也高達90%以上。尹杰等[7]基于編碼S基因的B、C抗原位點，建立的間接ELISA方法特異性和重復性均較好，且敏感性遠高于血清中和試驗，有望應用于TGEV的檢疫和進行流行病學調查。郭宏偉等[8]對N蛋白進行了表達，建立了可檢測TGEV血清抗體的間接ELISA方法，通過與中和試驗比較，符合率為100%，且檢測假陽性和假陰性率低。

2.1.2病毒中和試驗

S蛋白突出于TGEV病毒粒子表面，是唯一能夠誘導機體產生中和抗體和提供免疫保護作用的結構蛋白。然而研究發現，TGEV與豬呼吸道冠狀病毒（porcine respiratory coronavirus，PRCV）序列存在高度的相似度，利用中和試驗檢測TGEV抗體時兩者之間存在交叉反應，降低了診斷的特異性，因此限制了中和試驗在TGE診斷的應用。

2.1.3膠體金技術

膠體金免疫層析技術具有操作簡單、靈敏度高、診斷結果直觀等優點，目前已經廣泛應用于細菌、病毒和寄生蟲等動物性疾病診斷。常亮等[9]利用檸檬酸納還原法制備的膠體金試紙條，可特異性檢測出低至150μg/mL的TGEV，該試紙條可在常溫下保存1年之久，有望用于生產實際。李嘉琛[10]等研發了一種可標記TGEV單抗的膠體金顆粒，將其包被在玻璃纖維膜上，并分別以羊抗鼠lgG和TGEV單抗為質控線和檢測線。結果顯示，該試紙條檢測靈敏度為102TCID50/O.1mL，且與RT-PCR檢測結果和進口試紙卡吻合。

2.2分子生物學診斷技術

2.2.1RT-PCR技術

PCR技術自出現以來，廣泛應用于分子生物學領域。RT-PCR是指以mRNA為模板，進行PCR擴增的技術。早在1997年，Pa-ton等[11]建立了一種基于S基因序列，檢測TGEV的RT-PCR方法，可用于與PRCV鑒別診斷。通過對臨床樣品進行檢測，發現RT-PCR敏感性優于傳統的病毒分離和ELISA檢測手段。Dong等[12]坷針對N基因保守區建立了RT-PCR檢測方法，通過對臨床樣品檢測發現，特異性和重復性100倍優于普通PCR。王黎等[13]針對N基因保守序列建立的RT-PCR方法，完成了幾百份臨床樣品的檢測，靈敏度高達1Opg。

2.2.2巢式RT-PCR （RT-nPCR）技術

巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈式反應，通過采用兩對特異性引物對目的基因進行擴增，大大提高了反應的敏感性和特異性。20世紀80年代以來，出現了一種新的名為PRCV的TGEV變異毒株。與TGEV相比較，僅在S基因的5端672位和681位之間出現了缺失。美國學者Kim[14]基于S基因缺失片段，首次建立了可用于PEDV和PRCV鑒別診斷的RT-nPCR技術，可直接對糞便樣品進行檢測。隨后，Jung等[15]建立了一種新的雙重RT-nPCR技術，可同時檢測出組織病理切片中PEDV和TGEV，與原位雜交技術相比較，吻合率為100%。Salem等”[16]進一步建立了多重RT-nPCR，可同時檢測出發生腹瀉的樣品中PEDV、TGEV和PRV感染情況。該方法可檢測到的TGEV下限濃度為102TCID50/mL。Rodrl guez等[17]通過對TGEV高度保守區設計引物，建立了可用于檢測組織培養和臨床樣品中TGEV含量的RT-nPCR，有助于對豬場TGEV做出診斷。

2.2.3雙重或是多重RT-PCR

雙重或多重RT-PCR可通過在檢測體系中加入1對以上的特異性引物，從而實現對兩種以上病原微生物檢測的目的，該方法在混合感染樣品檢測中顯得尤為重要。TGEV常和PEDV、PGAR混合感染，且臨床癥狀、病理變化和流行病學極為相似，因此需要借助實驗室檢測技術才可以做出確診。

早在2007年，Kim等[14]就建立了同時可以檢測和定量PEDV和TGEV的多重RT-PCR法。人為感染試驗結果顯示，腹瀉剛一出現便可采用該方法檢測到PEDV和TGEV。張坤等[15]根據PEDVM基因、TGEVN基因、PGARVP7基因建立的多重PCR可檢測到最低35pg限量的三聯疫苗混合RNA。通過對75份豬糞便樣品進行檢測分析，與常規RT-PCR相比較，該技術特異性強、敏感度高，可用于檢測腹瀉樣品中的PEDV、TGEV和PGAR。我國學者陳芳等[19]為了對TGE和PED混合感染做出準確的鑒別診斷，建立了同時可檢測這兩種病原體的雙重PCR方法，結果表明可檢測出lOpg TGEV RNA和lOOpg PEDV RNA。閆若潛等[20]也建立了特異性較好的PEDV和TGEV二重PCR檢測方法，可檢測到lOTCID50/mL的病毒含量。

2.2.4熒光定量PCR（qRT-PCR）技術

qRT-PCR技術具有靈敏度高、可實時定量的特點，已經廣泛用于分子生物學和醫學檢測，對于疾病的高通量檢測具有明顯的優勢。2007年，Bai等[21]建立的基于TaqMan探針的qRT-PCR方法，可檢測15.3拷貝/μL的質粒DNA，遠高于普通PCRl.53x103拷貝/μL的檢測極限，且具有良好的重復性和特異性。Vemula-palli等[22]通過對TGEV的S基因進行序列比對，設計出特異性引物并引入綠色熒光蛋白作為內參，建立的TaqMan熒光定量RT-PCR技術，可用于糞便樣品檢測，靈敏度可達2.8個拷貝，且能與其他種豬呼吸道病毒冠狀病毒鑒別診斷。龔雙燕等[23]建立的SYBR Green Ⅱ qRT-PCR檢測方法可用于提高初乳中TGEV檢出率。通過對130份腹瀉母豬的初乳進行檢測，qRT-PCR可檢測出10份陽性樣品，而普通PCR僅檢測5份，說明建立的熒光定量PCR檢測敏感性高，更加適用于病毒微量的樣品檢測，提高了檢出率。侯月娥等[24]建立的雙重TaqMan熒光定量一步法qRT-PCR，可同時檢測PEDV和TGEV，靈敏度均可達101個拷貝，可快速完成對臨床樣品的檢測。

2.2.5反轉錄環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術（Loop-Media ted lsothermal Amplifi-cation，LAMP）是一種新的核酸擴增方法，其可在等溫條件下擴增出DNA/RNA，并具有較高的特異性和靈敏性，且無需特殊的設備，已經廣泛用于口蹄疫病毒、流感病毒以及豬水皰病毒等多種RNA病毒的檢測。Chen等[25]針對TGEV保守的N基因，設計出6對特異性引物，可檢測到1Opg病毒RNA，靈敏度遠高于普通PCR。Li等[26]采用3對N基因的特異性引物，通過優化條件后，60℃孵育30min便可以較高靈敏度檢測出TGEV，并能與其他病毒進行鑒別診斷。該方法簡便易行，適用于TGEV現場診斷。

3小結與展望

TGE在世界范圍內廣泛流行，給養豬業造成了巨大的經濟損失。因此，對TGE高效、特異性診斷顯得尤為重要。目前，對于TGE尚需要借助實驗室診斷技術，才能減少診斷的誤差，提高診斷的準確性。其中，分子生物學診斷技術具有高效、快捷、準確等優點，在實驗室中得到了廣泛的應用。RT-nPCR和多重PCR的出現，提高了檢測的效率和特異性，特別是qRT-PCR技術的應用大大提高了檢測的特異性和靈敏性。但是，受到儀器設備條件的限制，尚無法應用到臨床現場診斷。

隨著科技的進步，多種便捷式的檢測手段問世，有望對豬病現場進行TGE診斷。近幾年，膠體金診斷試紙條的出現對于提高臨床檢測提供了巨大的方便，特別適用于廣大基層獸醫工作者，這也是今后科學研發的一個重要方向。目前豬病復雜多樣，且多為混合感染，這給疾病的鑒別診斷帶來了很大的挑戰。因此需要綜合運用多種檢測方法，揚長避短，才能提高檢測的靈敏性和特異性，更好服務于我國乃至世界的養豬業發展。

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