小兒厭食癥模型大鼠血清代謝組特征探析

張鴻彬，藺湘寧，王鵬飛，尚菁，王強，李玉霞，段淑文，王小榮*

(1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.石家莊平安醫院，河北 石家莊 050000)

小兒厭食癥(Infantile anorexia,IA)[1]是指以小兒長期食欲減退或食欲缺乏為主要癥狀的一種疾病。中醫古代文獻中并無厭食癥病名，但依據證候學可將其歸為“傷食”“積滯”“疳積”等范疇。屬于學齡前兒童和青少年時期最為常見的疾病之一，由于這個時期的兒童正處于生長發育期，若不能攝取足夠的營養物質，則會影響正常發育，出現發育遲緩，免疫力下降和智力障礙等一系列問題。

代謝組學是近年來發展起來的一種新興學科，是研究生物體被擾動后其代謝產物(一般指相對分子質量<1 000的小分子代謝物質)的種類、數量及變化規律的科學[2]。代謝組學技術已經在實驗動物模型評價中展現了其特色和明顯的優勢[3-4]。但關于IA的代謝組學研究目前還少有報道，本研究利用代謝組學研究方法，以IA模型大鼠血清為研究對象，采用LC-Q/TOF-MS液相色譜-質譜聯用技術，通過化學計量學模式識別的方法，發現潛在生物標志物并鑒定，解析代謝通路，初步從代謝組學角度探析IA的生物學本質。

1 材料

1.1 儀器與設備

采用美國安捷倫科技公司LC-Q/TOF-MS儀器分析平臺；VELOCITY 18R臺式高速離心機(澳大利亞Dynamica公司)；DV314C精密電子分析天平(美國奧豪斯公司)；ULFT386冰箱(美國Thermo公司)。

1.2 試劑與藥物

LC-MS級乙腈(德國Merck公司)；HPLC級甲醇(德國Merck公司)；甲酸(上海CNW公司)；超純水(德國Merck公司)；2-氯苯丙氨酸[吉爾生化(上海)有限公司]；高脂飼料(北京科奧協力飼料有限公司)。

1.3 實驗動物

斷乳后1周齡的SPF級SD大鼠120只，雌雄各半，體質量(60±10)g，由甘肅中醫藥大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(甘)2015-0005。飼養于甘肅中醫藥大學科研實驗動物中心，環境溫度(22±2)℃，相對濕度(50±20)%，明暗周期為12 h。

2 實驗方法

2.1 實驗分組

適應性喂養1周后，按雌雄及體質量根據隨機數表法分為空白組(K組)20只，模型組(M組)100只。

2.2 模型制備

參照汪受傳等[5]特制高脂飼料喂養幼齡大鼠建立IA模型的方法，各組大鼠雌雄分開，空白組以常規飼料喂養，模型組以高脂飼料喂養(采用奶粉、玉米粉、鮮雞蛋、鮮肥肉、魚肉松、黃豆粉和白糖按比例混勻制成)，自由進食飲水，共飼養5周。實驗過程中，每日定時稱取和記錄大鼠食量和體質量。當模型組大鼠食量降低40%～60%，或者當體質量低于正常組的10%～15%，但不出現蜷臥、弓背聳肩以及腹瀉等脾虛癥狀時，即認為造模成功。

2.3 樣本采集與預處理

實驗最后各組股靜脈取血4 mL，備檢。血清標本處理：室溫靜置1 h使血液凝固析出血清，用離心機以4 000 r/min轉速離心10 min，用移液器收集上清液，放置到-80 ℃冰箱保存，待檢。

2.4 樣本前處理與檢測

將大鼠血清樣本從冰箱取出，放置室溫解凍，每個樣本取100 μL血清樣本至1.5 mL EP管中，然后加入300 μL甲醇，并加入10 μL的內標(2.9 mg/mL，2-氯苯丙氨酸)，渦旋30 s，4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min。取上清液200 μL，轉入進樣小瓶中進行檢測。

2.5 色譜條件

C18色譜柱(Agilent，100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，柱溫40 ℃，流速0.35 mL/min；流動相組成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；進樣量為4 μL，自動進樣器溫度4 ℃。

2.6 質譜條件

采用ESI離子源，同時進行正負全離子模式掃描。正離子模式條件為：毛細管電壓4 kV，錐孔電壓35 kV，離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃，反向錐孔氣流50 L/h，脫溶劑氣600 L/h，萃取錐孔4 V。

負離子模式檢測條件：毛細管電壓3.5 kV、錐孔電壓50 kV、離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度300 ℃、反向錐孔氣流50 L/h、脫溶劑氣700 L/h、萃取錐孔4 V。離子掃描時間0.03 s、掃描時間間隔0.02 s、數據采集范圍：50～1 000 m/z。

2.7 數據處理

2.7.1 統計學處理

2.7.2 代謝組學數據處理

所獲得樣本數據用Mass Profiler軟件(Agilent公司)進行預處理，并在Excel 2010中進行后期編輯，將最終結果組織為二維數據矩陣，包含保留時間、分子量、觀察量(樣本)和峰強等信息。對數據進行歸一化處理后導入SIMCA-P 13.0軟件進行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。采用OPLS-DA模型的VIP值(閾值>1)，并結合t檢驗的P值(P<0.05)來尋找差異性表達代謝物。搜索在線數據庫(Metlin)為差異性代謝物定性。應用MetPA網絡構建分析代謝通路，將篩選出的代謝物的HMDB編號輸入進行代謝通路分析，然后通過檢索代謝途徑數據庫KEGG，并結合相關文獻、生物化學及分子生物學知識，探討潛在生物標志物相關生物學意義。

3 結果

3.1 攝食量、體質量變化情況

適應性喂養7天后，開始正式實驗，并記錄相關數據，動態觀察兩組大鼠的生長狀況，M組大鼠在造模后第7天開始食量、體質量低于K組，持續4周，統計學處理均有顯著性差異。見表1、表2和圖1。M組大鼠從第28天開始日進食量低于K組40%～60%，體質量從第7天開始比K組降低10%～15%，不伴有腹瀉、毛枯、少動等其他癥狀，符合IA的臨床表現，提示造模成功[5]。

組別第1 d第7 d第14 d第21 d第28 d第35 d總計F值PK組7.45±0.9411.49±1.4314.44±1.9316.07±2.1420.14±3.0623.41±3.5515.5±0.64199.67<0.001M組7.64±0.539.32±0.6910.42±0.9910.79±0.9911.24±1.0311.02±0.9910.07±0.08673.34<0.001總計7.63±0.579.52±1.0010.78±1.5911.27±1.8912.05±2.8912.14±3.84—1 139.7?<0.001?t值-0.6364.7446.5247.7299.13611.014313.32?(F=484.08,P<0.001)#P0.5390.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001?

注：*主效應的F值和P值；#交互效應的F值與P值。

組別第1 d第7 d第14 d第21 d第28 d第35 d總計F值PK組62.30±8.0696.30±9.30140.90±19.49177.80±20.50202.60±24.10236.90±32.54152.80±5.42261.88<0.001M組62.08±2.5988.06±6.87120.94±15.74149.28±16.55166.61±13.44199.19±17.58131.03±1.185 789.25<0.001總計62.10±3.3888.81±7.46122.75±17.02151.87±18.74169.88±17.89202.62±22.06—2 260.45?<0.001?t值0.0863.4963.7415.0844.653.61328.16?(F=38.23,P<0.001)#P0.9330.001<0.001<0.0010.0010.005<0.001?

注：*主效應的F值和P值；#交互效應的F值與P值。

圖1 大鼠食量、體質量方差輪廓圖

3.2 原始色譜圖的可視化結果

經過色譜柱分離流出的組分不斷進入質譜，質譜連續掃描進行數據采集，每次掃描得到一張質譜圖，離子強度為縱坐標，時間為橫坐標，正模式下單個樣本TIC圖(圖2)所示，M組與K組的圖譜在同一時間點的峰度值差異較大，提示該處的化合物信息有較大差異，IA模型大鼠體內代謝被擾動。

3.3 血清代謝組學分析

實驗首先使用PCA進行比較，顯示兩組明顯區分(圖3)。為了進一步驗證分類的可靠性，采用了OPLS-DA對兩組樣本重新建模分析,得到很好的區分模型(圖4)。

注：K：空白組；M：模型組。圖2 單個樣本TIC圖

注：A：正模式；B：負模式。圖3 M-K兩組的PCA得分圖

注：A：正模式； B：負模式。圖4 M-K兩組的OPLS-DA得分圖

3.4 IA潛在生物標志物鑒定

根據OPLS-DA模型的VIP值(閾值>1)，結合t檢驗的P值(P<0.05)來尋找差異性代謝物。利用質譜的質核比或者精確分子質量搜索HMDB，METLIN，KEGG等在線數據庫，檢索到相對應的化合物，得到30個差異性代謝物，見表3。

表3M-K兩組的差異性代謝物

名稱VIP保留時間分子量P值離子模式趨勢膽紅素2.487.714584.263 5<0.001+↑膽堿1.880.661103.099 80.002+↓檸檬酸1.391.037192.027 30.028+↓D-β-羥基丁酸1.501.264104.047 60.016+↓左旋肉堿1.890.683161.105 30.002+↓L-谷氨酸2.120.693147.053 3<0.001+↓L-組氨酸1.500.644155.069 00.017+↓LysoPC(14:0)1.7811.181467.300 00.002-↑LysoPC(15:0)1.5411.618481.315 30.007-↑LysoPC(16:1(9Z))1.4010.109493.317 20.026+↑LysoPC(20:2(11Z,14Z))1.2911.277547.364 50.041+↑LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))1.4310.259543.333 10.023+↑LysoPC(22:2(13Z,16Z))2.4712.515575.394 9<0.001+↑LysoPC(22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))1.6111.120571.364 00.010+↑LysoPC(22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))1.8310.819569.348 30.003+↑煙酰胺1.531.002122.048 20.014+↓磷酸膽堿1.4310.744183.066 20.023+↓磷酰膽堿2.126.961169.052 8<0.001+↑植物鞘氨醇1.328.009317.293 20.036+↓維生素A酸2.1710.931300.209 2<0.001+↓磷酸鞘氨醇2.489.645381.264 5<0.001+↓神經鞘氨醇1.639.317299.282 70.009+↓12-酮基脫氧膽酸1.308.813390.274 80.025-↑4-甲基馬尿酸1.335.184193.072 10.021-↓乙酸1.470.66060.021 30.011-↓脫氧膽酸1.589.038392.290 50.006-↓油酸1.1614.523282.254 90.047-↓牛磺膽酸1.407.469515.289 90.015-↑?；敲撗跄懰?.587.412499.294 70.006-↑尿酸1.870.995168.027 00.001-↓

注：名稱為差異代謝物名稱；VIP為OPLS-DA模型構建時不同物質對模型的貢獻率；P值為t檢驗得到顯著性值；趨勢是M組相對于K組的趨勢。

3.5 代謝通路分析

應用MetaboAnalyst 3.0分析代謝通路。利用拓撲分析，代謝通路影響的臨界值設置為0.01，大于該值將選擇作為潛在的關鍵代謝通路(圖5，表4)。如圖5所示，圖中圓點越大、顏色越紅，說明富集的差異代謝物越多，差異代謝物對該點代表的通路的影響越大。

表4IA模型大鼠代謝通路

NO.相關代謝途徑代謝物總數期望值擊中值-log(P)影響值1鞘脂類代謝210.6333.780.202精氨酸和脯氨酸代謝441.3243.230.173甘油磷脂代謝300.9032.850.114組氨酸代謝150.4522.630.245D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝50.1511.961.006谷胱甘肽代謝260.7821.710.077卟啉與葉綠素代謝270.8121.650.048煙酸和煙酰胺代謝130.3911.120.249乙醛酸和二羧酸代謝160.4810.950.3010視黃醇代謝170.5110.900.2211三羧酸循環200.6010.780.0512丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代謝240.7210.650.2613嘌呤代謝681.3112.980.0214丙酮酸代謝220.4222.730.06

注：橫坐標表示通路影響值；縱坐標表示轉換后的P值。圓點的大小表示富集的差異代謝物數量，點越大，富集代謝物越多。顏色表示顯著性，顏色越深，P值越小。圖5 代謝通路影響值

4 討論

中醫學認為，小兒為稚陰稚陽之體，臟腑嬌嫩，形氣未充，具有“三不足、四有余”的特點，任何影響到脾胃運化的因素都可導致厭食的產生。如錢乙《小兒藥證直訣》中言：“脾胃不和，不能乳食，致肌瘦”，《幼幼集成·積食證治》云：“脾虛不運則氣不流行，氣不流行則停滯而為積，或作瀉痢，或成痞，以致飲食減少”。本研究從代謝組學的角度探析IA的生物學特征，以期為IA的進一步研究提供參考。

結果顯示，M組與K組之間代謝差異物主要集中在脂類代謝、氨基酸類代謝和三羧酸循環等代謝途徑中，提示IA的發病過程與這些代謝的紊亂有密切的關系。

膽堿作為甘油磷脂代謝的產物，是神經遞質乙酰膽堿的合成前體物質，并且是磷酰膽堿、溶血卵磷脂(LysoPC)和鞘磷脂的組成成分，在動物大腦發育和維持神經的正常功能方面起著重要作用，研究發現生長期幼鼠缺乏膽堿會造成大腦結構和功能永久性損傷[6-9]。膽堿作為人和動物生長發育必需的營養物質[10]，其代謝的紊亂對細胞膜的穩定性，信號基質的傳遞都會造成一定的干擾，最終擾動細胞的正常生理活動[11]。磷酰膽堿的降解產物磷脂質是構成細胞脂質雙分子層的關鍵成分，并在信號傳導和代謝中起著重要作用[12]。溶血卵磷脂通過磷脂酶水解磷脂酰膽堿生成，可以啟動卵磷脂受體，進行酯信號傳導，完成膜內外蛋白的交換[13]。M組膽堿下降，溶血卵磷脂和磷酰膽堿上升，這種變化擾動了的甘油磷脂代謝通路，其代謝通路的整體變化也會引起甘油磷脂功能的異常，從而可能引起細胞生理平衡的紊亂。

4.1 氨基酸代謝

谷氨酸、組氨酸在IA模型大鼠血清中含量較K組顯著降低，表明氨基酸代謝在IA發病過程中受到很大的影響。L-谷氨酸是蛋白質的主要構成成分，雖然不是人體必需氨基酸，但可作為碳氮營養參與機體代謝，有較高的營養價值[10]。在氨基酸合成途徑中，谷氨酸又是合成谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸、賴氨酸和谷胱甘肽的重要前體。谷氨酸在上皮細胞和草酰乙酸通過氨基交換產生α-酮戊二酸和天冬氨酸。谷氨酸在丙酮酸存在的情況下能通過轉氨產生丙氨酸和α-酮戊二酸。通過氨基交換產生的α-酮戊二酸能夠進入線粒體，然后進入三羧循環產生還原性輔酶用于線粒體ATP的合成。谷胱甘肽由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，在維持細胞正常生理活動中具有重要作用，能幫助保持正常的免疫系統的功能，并具有調控營養代謝和細胞的抗氧化等功能[13]。組氨酸是一種半必需氨基酸，對嬰幼兒及動物的成長尤為重要，研究發現幼齡動物和嬰兒體內的組氨酸合成量不能滿足機體生長需要，這些氨基酸代謝的紊亂，直接影響到機體的正常生理功能，與IA的發病有著密切的關系。

4.2 三羧酸循環

三羧酸循環是糖、脂肪和蛋白質在體內徹底氧化的共同代謝途徑，也是機體質量要的能量供應渠道。檸檬酸是三羧酸循環中重要的中間產物，本研究中檸檬酸含量顯著降低，提示IA模型大鼠三羧酸循環發生紊亂。三羧酸循環另一重要功能是為其他合成代謝提供小分子前體，例如α-酮戊二酸和草酰乙酸分別是合成谷氨酸和天冬氨酸的前體，三羧酸循環的紊亂直接導致機體供能的紊亂及間接影響氨基酸的合成，影響機體的正常生理功能。D-β-羥丁酸是一種酮體，可在體內轉化成乙酰乙酸,經三羧酸循環代謝，當機體代謝發生紊亂,不能正常利用葡萄糖時，心、腦等器官可利用酮體氧化分解供能，使D-β-羥丁酸含量降低，這些都說明IA的發病與三羧酸循環的紊亂有密切的關聯。

進食高脂飲食會增高血膽酸水平[14]，IA模型大鼠血清中牛磺膽酸和?；敲撗跄懰崴缴撸治鲈蚩紤]是IA模型大鼠一直以特制高脂飼料喂養，而高脂飲食可能改變了腸道的膽酸代謝。同時腸道菌群與膽酸代謝又互相影響[15-16]，研究發現，高脂飲食可影響腸道菌群的構成，使甘氨膽酸向?；悄懰徂D化，以利于疏水性強的高脂飲食消化吸收[17]，因此，本研究觀察到IA模型組脫氧膽酸水平降低，?；悄懰崴缴邞撌悄c道菌群的一種適應性調節反應。并且結果顯示馬尿酸在模型組代謝發生了紊亂，這些含苯基的代謝產物主要是腸道菌群對酚類物質代謝產生的[17-19]，表明腸道菌群在IA發病過程中的發生了變化，說明IA發病過程中存在腸道菌群的紊亂。研究顯示新生兒腸道菌群缺乏或者使用廣譜抗菌藥引起的腸道菌群紊亂，均會減少腸腔內膽紅素的還原和糞便中尿膽素樣物質的排泄，導致腸腔內未被還原的膽紅素大量進行腸肝循環，從而影響膽紅素的動態平衡和其在血中的水平[20]，導致血清中膽紅素水平升高，這和實驗中IA模型組大鼠膽紅素升高的結果一致。這些代謝物的變化反映了IA的一些生物學特征，可以進一步篩選作為IA的特異性標志物，為后續研究提供一定的參考。

綜上所述，IA的發病涉及多種代謝紊亂，高脂飼料喂養的大鼠代謝產物可能引起脂質代謝、氨基酸代謝和能量代謝的紊亂，最終導致本病的發生。同時發現IA患者可能同時存在腸道菌群失調的問題，還待進一步研究。本研究從整體水平反映了IA發病過程中內源性小分子的代謝變化，有助于其代謝網絡的全面構建及疾病發病機制的闡釋，為IA的診斷、治療以及特效藥物的開發與評價提供一定的依據。