酸棗仁湯對抑郁模型大鼠海馬CaMKⅡ基因表達影響的實驗研究

田旭升，張策，龔永濤，王超穎，楊彬

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

抑郁癥(depression)作為一種精神疾病，具有持久顯著的心境低落與認識功能障礙等特征，缺乏愉快感，伴有罪惡感、失眠、厭食、抑郁焦慮等情感功能障礙。根據世界衛生組織統計，全球組織研究顯示，目前抑郁癥已經成為“世界第三大負擔疾病”，抑郁癥的平均發生率約為3.1%，在發達國家接近6%[1]，被精神科醫生和心理學家喻為“精神科的感冒”。 據推測，每年因罹患抑郁癥而輕生離世的人數超過了100萬人[2]。目前臨床上常用藥SSRIs類以及SNRIs治療抑郁癥的效果雖然較好，但是兩類藥物在臨床中的安全性、耐藥性以及用藥成本，成為患者備受關注的焦點。

中醫藥對抑郁癥的防治具有獨特的療效。夏寒星[3]研究發現,酸棗仁湯可以顯著改善慢性應激大鼠的興趣喪失、活動能力下降等精神運動性抑郁癥狀。張仲景著《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治》中記載：“虛煩虛勞不得眠，酸棗仁湯主之。”酸棗仁湯為抑郁癥的現代治療提供了新觀念和新角度。

現有眾多研究資料顯示，通過CaMKⅡ信號轉導通路活性，參與海馬神經元重塑已經成為對抑郁癥發病原因研究的新突破口。本實驗以抑郁模型大鼠的建立為基礎，通過正常對照組、模型組、氟西汀組的比較，觀察酸棗仁湯對抑郁模型大鼠海馬內的CaMKⅡ蛋白及基因表達的影響，結合行為學的改變，探索酸棗仁湯可以改善大鼠抑郁癥狀指標，為酸棗仁湯可以有效治療抑郁提供依據。

1 實驗材料

1.1 動物

清潔級SD雄性大鼠48只，體質量130～230 g;黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供，合格證號：SCXK(黑)2014-0008;實驗所需的SD大鼠專用飼料，由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供，所有飼料利用高壓滅菌等步驟，經過了嚴格的處理。

1.2 藥物

酸棗仁湯(酸棗仁20 g、茯苓10 g、知母10 g、甘草5 g和川芎10 g)劑量主要參考《金匱要略》記載，方中所需中藥飲片均購買于黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院藥局，水煎濃縮，制備成低(0.5 g/mL)、中(1 g/mL)和高(2 g/mL)3種劑量，放入4 ℃冰箱保存備用。氟西汀(法國禮來蘇州制藥有限公司，批號：4510A)；兔抗多克隆一抗、二抗PV6001、DAB顯色劑(北京中山公司，中國)；其他試劑為國產分析純。

1.3 試劑

TRIZOL試劑、氯仿和75%乙醇 (北京索萊寶科技公司)；CaMK Ⅱ引物、β-actin引物、MasterMix2溶液(三博遠志生物技術公司)；Real-time PCR熒光染料(寶生物工程(大連)有限公司，中國)；RIPA裂解液、兔抗多克隆一抗、二抗(天津廣成化學試劑公司)；蔗糖(天津巴斯夫化學試劑公司)

1.4 儀器

免疫組織化學實驗試劑盒(基因科技有限公司，中國)；恒溫冰箱(日本三洋電器有限公司)；電子天平、攝像頭、烘箱(沈陽龍騰電子公司)；低速自動平衡離心機(中國LDZ-2型)；7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；電擊箱(北京醫科院藥研所)；石蠟切片機萊卡2135型(德國)；Moticam3000顯微攝影成像系統(美國)；上海恒電熱恒溫箱；醫學數碼圖像分析系統(麥奧迪克廈門公司)5810R高速低溫離心機、移液槍(德國Eppendorf公司)；液氮罐(中國亞西有限公司)；-80 ℃冰箱(美國Thermo Firsher)；自制曠場實驗箱。

2 方法

2.1 動物分組方法及給藥方法

實驗前3天對大鼠進行適應性飼養，參考體質量、蔗糖水消耗以及行為學測試評分，將48只大鼠隨機分成6組，每組8只。造模(除空白組)7天以后，連續灌胃21天。大鼠給藥量不宜過多，結合大鼠體表面積與成人體表面積的比例進行換算，再按照成人1天的藥量給藥。

正常對照組和模型組給予10 mL/kg 0.9%生理鹽水灌胃，氟西汀組給予0.36 mg/mL氟西汀混懸液灌胃，酸棗仁湯低中高劑量組分別給予濃度為0.5 g/mL、1 g/mL和2 g/mL的酸棗仁湯灌胃，6組均每日灌胃1次。

2.2 抑郁模型制備

空白組大鼠每籠8只，在實驗過程中不接受任何形式的刺激，根據實驗流程正常飼養。其他組別大鼠進行孤養，每籠1只大鼠。在28天實驗時間里，非空白組的大鼠每天都要接受共計7種不同慢性刺激，每天進行1種，構建慢性輕度不可預見性應激大鼠抑郁(CUMS)模型，其中，相同的刺激形式不可以連續進行。應激方法根據Banasr方法略微改進，刺激方式如下：

禁水：給予大鼠12 h斷水，于造模當天8:00—20:00進行12 h斷水，斷水期間內正常給予食物。

禁食：給予大鼠12 h斷食，于造模當天8:00—20:00進行12 h斷食，斷食期間給予正常飲水。

傾斜鼠籠：將鼠籠傾斜45°，持續12 h后將鼠籠恢復到原位。

墊料潮濕飼養：向鼠籠中加水，使墊料潮濕，墊料潮濕狀態持續12 h后換掉。

晝夜顛倒：晚上7點將日光燈打開，持續12 h，使大鼠在夜間處于光照狀態。

45 ℃烘箱熱烘刺激：把大鼠放進溫箱，溫箱保持在45 ℃，持續10 min。

液態水游泳：將大鼠放入盛有-10 ℃冷水的桶中，讓大鼠的足尖離開桶的底部即可，讓大鼠在水中持續5 min左右，之后用吹風機將大鼠身體吹干，防止大鼠受涼。

2.3 實驗觀測內容及方法

氟西汀組和酸棗仁湯各劑量組在造模第8天開始分別給予氟西汀藥物和酸棗仁湯各劑量組進行干預。正常對照組和模型組分別急于生理鹽水灌胃。實驗第0天和第28天，分別測量并觀察每只大鼠體質量變化、蔗糖水消耗量、行為學得分情況。在實驗第28天，對各組大鼠進行海馬取材，應用RT-PCR檢測大鼠海馬內CaMK II蛋白mRNA的表達情況，Western-blot方法檢測CaMK II蛋白的表達情況。

2.3.1 大鼠體質量測量

觀察各組大鼠體質量的變化，在實驗的第0天、第7天、第14天、第21天和第28天對大鼠進行體質量測量，然后記錄。總結數據進而進行統計分析，分析體質量改變與抑郁發作的關系。

2.3.2 大鼠糖水消耗試驗

大鼠的糖水消耗檢測于實驗的第0天、第7天、第14天、第21天和第28天開始進行。大鼠糖水消耗試驗前一天，要對各組大鼠進行相應準備，包括禁水及禁食的刺激。之后更換大鼠飲用水，每瓶150 mL，換成1%濃度的蔗糖水，持續禁食狀態。實驗持續12 h后，整理記下所有瓶中蔗糖水量的剩余量，根據差值得出糖水的消耗量。利用大鼠對糖水的偏好，觀察動物快感缺乏情況以及改善情況。

2.3.3 曠場實驗測試

大鼠體質量檢測完畢后，在實驗的第0天、第7天、第14天、第21天和第28天進曠場實驗[6]。測試裝置是一個木箱，木箱長、寬各為1 m，高約0.8 m，箱底內部有25個16 cm×16 cm的小方格。測量的計分方式是：測量得分分為垂直活動得分和水平活動得分。垂直活動得分標準是大鼠前肢抬起，后肢保持直立。水平活動得分標準是大鼠四肢共同處于1個方格內。測試大鼠達到標準時計1分。測量時，將測試大鼠放在木箱底部的中心處，檢測過程中要保證減少額外干擾比如排除光照、溫度、時間以及環境噪音的干擾。事先熟練掌握檢測標準，有助于再正式檢測前減少人為的誤差。計時3 min，統計活動時間內大鼠水平、垂直活動得分。計算得分人數為2人或2人以上，其中1人負責觀察并記錄時間，其他人負責記錄大鼠水平及垂直活動得分。

2.3.4 大鼠海馬內CAMK II的蛋白測定

實驗第28天，檢測大鼠體質量、糖水消耗實驗及曠場實驗得分等指標。之后每組選取4只大鼠，麻醉后斷頭，打開顱腔，取雙側海馬組織，迅速分裝于凍存管中，放入-80 ℃液氮罐中速凍，速凍后將組織放入-80 ℃冰箱中保存。

2.3.4.1 RT-PCR法測定大鼠海馬內CaMK ⅡmRNA表達方法

1)取凍存細胞，室溫放置5 min使其完全溶解,然后放置玻璃勻漿器中，按20:1的比例加入TRIZOL后勻漿至無明顯組織塊，靜置5 min，使組織液達到完全裂解狀態。

2)加入100 μL氯紡，振蕩均勻，靜置15 min，4 ℃，離心12 000 r/min，棄上清，使RNA沉淀于管底，加入1 mL的75%乙醇，振蕩離心，清洗沉淀，4 ℃，7 500 g，離心5 min，棄上清，將沉淀晾干，用20 μL無RNA酶水溶解RNA沉淀。

3)加入引物與Mix液：

CaMK II引物：

上游引物序列：5′AAGATGTGCGACCCTGGAATG3′。

下游引物序列：5′TGTAGGCGATGCAGGCTGAC3′。

β-actin引物：

上游引物序列：5′AGCGGGAAATCGTGCGTG3′。

下游引物序列：5′CGTGGTGGTACATGGGAC3′。

配置MasterMix2溶液，4℃，用移液槍將MasterMix2濃縮液、引物、模板加入平行孔中，每個樣品至少做3個平行孔，加入平行孔時每孔均要更換新的槍頭，所用成分加完后，離心去除氣泡。

4)RT-PCR反應：反應過程于熒光定量基因擴增PCR檢測系統進行，設置反應條件：94 ℃預變性，5 min，進入下一循環。94 ℃，30 s，退火40 s，72 ℃，40 s，35個循環后，72 ℃延伸10 min，擴增CaMK II片段和β-actin片段。

5)監測各循環熒光值，數據分析由自帶系統軟件自動完成，同時通過軟件可以確定Ct值(所有標準品和樣品的起始循環數)。根據Ct值繪制出的標準曲線，可計算出樣本的初始拷貝數。用比較閾值法來測定目的基因的相對表達情況。

2.3.4.2 Western-blot法測定CaMK Ⅱ蛋白方法：

1)取凍存細胞，室溫放置5 min。將提取的大鼠海馬按照100 mg/mL加入200 μL RIPA裂解液，加入蛋白酶抑制劑后勻漿。

2)靜置1 h后，將其放置于冰上，在4℃下進行12 000 r/min離心操作，持續30 min。

3)提取上清液測定總蛋白濃度，測得結果后置于-80 ℃冰箱凍存備用。

4)SDS聚丙烯酰胺通過凝膠電泳，使25 μg總蛋白樣品分離，使之發生轉移，附著到PVDF膜上。

5)TBST配制脫脂奶粉，濃度5%，室溫封閉，持續1 h，加兔抗CAMKII單克隆抗體，4 ℃冰箱中孵育過夜。

6)分別加羊抗兔二抗、羊抗大鼠二抗室溫孵育2 h。

7)每次孵育完后TBST漂白，持續10 min，反復操作3次。

8)將膜用P10-LightHRP化學發光液室溫孵育，時間持續5 min，之后封入保鮮膜，暗室內壓入膠片，進行曝光顯影。

9)顯影后，利用圖像分析軟件測定目的CAMK II蛋白與內參蛋白β-actin的灰比度。

2.4 統計學處理

3 結果

3.1 酸棗仁湯對大鼠一般狀態的影響

第0天各組大鼠反應迅速、皮毛光亮、活潑好動，對外界刺激反應敏感，而在第28天，相較于空白組，模型組大鼠反應遲鈍、少動、皮毛灰暗、蜷縮于箱角，對外界刺激少有回應。

3.2 酸棗仁湯對大鼠體質量的影響

第0天各組大鼠體質量無明顯差異(P>0.05)，第28天后，相較于模型組，酸棗仁湯中、低劑量組增長速度加快，有顯著性差異(P<0.05)；氟西汀組與酸棗仁湯高劑量組增長速度明顯加快，差異極其顯著(P<0.01)，結果見表1。

3.3 酸棗仁湯對大鼠蔗糖水消耗

第7天各組大鼠糖水消耗無明顯差異(P>0.05)，實驗第28天后，與模型組比較，其余各組糖水消耗增加，有顯著性差異(P<0.05)，結果見表2。

組別n第0 d第28 d空白組8201.50±7.37245.38±7.40??模型組8198.00±4.89205.35±8.65ΔΔ西藥組8202.48±3.41241.28±5.42??中藥低劑量組8205.02±3.11230.30±4.29ΔΔ?中藥中劑量組8204.02±7.84234.05±9.52Δ?中藥高劑量組8204.63±3.12243.94±4.88Δ??

注：和模型組比較，*P<0.05,**P<0.01；和空白組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

組別n第0 d第28 d空白組885.53±7.52161.68±32.04??模型組883.55±8.6039.96±12.94ΔΔ西藥組880.28±8.55120.61±10.54?中藥低劑量組889.18±7.42102.73±38.38?中藥中劑量組888.83±7.36112.33±82.63?中藥高劑量組882.03±9.43108.13±23.62?

注：和模型組比較，*P<0.05,**P<0.01；和空白組比較，ΔΔP<0.01。

3.4 酸棗仁湯對大鼠曠場實驗垂直、水平運動得分的影響

實驗第0天，各組大鼠垂直得分無明顯差別(P>0.05)，第28天，與空白組相比，模型組垂直得分明顯減少，有顯著性差異(P<0.01)，出現類似抑郁癥的癥狀，從行為學的角度觀察，可得出抑郁癥造模成功；酸棗仁湯低，中劑量組，得分均高于模型組，有顯著性差異(P<0.05)，酸棗仁湯高劑量組和氟西汀組，得分均明顯高于模型組，差異極其顯著(P<0.01)，結果見表3。

組別n第0 d第28 d空白組8102.73±12.8995.75±6.13??模型組8102.00±13.4424.51±6.02ΔΔ西藥組8110.24±12.3282.73±14.87??中藥低劑量組8104.25±7.6844.00±9.48ΔΔ?中藥中劑量組8111.52±11.8470.59±13.38Δ?中藥高劑量組8101.08±8.9898.25±14.41Δ??

注：和模型組比較，*P<0.05,**P<0.01；和空白組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

3.5 酸棗仁湯對大鼠海馬CaMK Ⅱ蛋白表達水平的影響

實驗結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠海馬CaMK Ⅱ表達水平有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，氟西汀組、酸棗仁湯低、中、高劑量組大鼠海馬CaMK Ⅱ表達水平無顯著性差異(P>0.05)。結果見表4。

組別n相對表達量(CaMKⅡ/β-actin/100%)空白組42.89±0.78?模型組41.60±0.51Δ西藥組42.03±0.82中藥低劑量組42.49±0.91中藥中劑量組41.83±1.51中藥高劑量組31.39±0.74

注：和模型組比較，*P<0.05；和空白組比較，ΔP<0.05。

各組大鼠海馬CaMK II蛋白條帶印跡的比較，結果顯示：模型組大鼠海馬CaMK II蛋白的表達條帶較正常對照組大鼠明顯變細，表明CaMK II蛋白表達減少；與模型組相比，氟西汀及酸棗仁各劑量治療組的蛋白條帶明顯變粗。中藥高劑量組蛋白條帶粗于中藥中劑量組；中藥中劑量組蛋白條帶粗于中藥低劑量組。結果見圖1。

注：1：模型組；2：正常對照組；3：氟西汀藥組；4：中藥低劑量組；5：中藥中劑量組；6：中藥高劑量組。 圖1 各組大鼠海馬中CaMKⅡ蛋白表達

3.6 酸棗仁湯對大鼠海馬CaMK ⅡmRNA表達水平的影響

RT-PCR方法檢測CaMK ⅡmRNA，實驗結果顯示，空白組表達量以1為基準，與空白組比較，模型組大鼠海馬CaMKⅡ表達水平有顯著性增高(P<0.05)；與模型組相比，氟西汀組、酸棗仁湯中、高劑量組大鼠海馬CaMKⅡ表達水平下降，有顯著性差異(P<0.05)。結果見表5，圖2。

4 討論

CaMK II是一種在腦組織尤其是海馬內高度表達的蛋白酶，在神經可塑性及記憶形成中具有重要的作用，是神經元內最重要的Ca2+受體蛋白，并且直接參與神經元的應激和修復過程[4-8]。大腦海馬區屬于腦區的邊緣系統，與學習、行為、情緒控制密切相關，也是應激損傷的主要器官。當CaMK II缺乏時可引起環磷酸腺苷/環磷酸鳥苷平衡失調，慢性刺激造成海馬神經元損傷，引起結構和功能的改變，影響長時程增強效應(LTP效應)，從而影響學習及記憶功能、情緒等方面的改變[9-10]。所以，CaMK II是神經細胞的保護因子，是抑郁癥及抗抑郁治療機制中重要的途徑，并在學習及記憶功能方面發揮重要作用。

組別n相對表達量(2-△△CT)空白組41模型組41.97±1.10Δ西藥組40.28±0.08?中藥低劑量組40.73±0.25中藥中劑量組40.41±0.11?中藥高劑量組40.32±0.09?

注：和模型組比較，*P<0.05；和空白組比較，ΔP<0.05。

圖2 各組大鼠CaMKⅡ mRNA水平比較

CaMK Ⅱ是突觸后致密物的重要組成部分之一，作用底物廣泛的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化蛋白激酶，占其蛋白總量約20%～30%。大多數具有激酶活性的蛋白分子在組織中的表達量都相對較低，所以CaMKⅡ在神經系統中高度表達必然具有其特殊意義。在信息傳遞中起關鍵的作用，對治療抑郁癥及預防抑郁癥發生的發病機制起重要作用。CaMK Ⅱ的功能失調與許多疾病發生有關，如抑郁癥、阿爾茨海默癥和癲癇等[9-12]。抗抑郁藥慢性起效的生物學機制包括神經突觸重塑的過程，CaMK Ⅱ蛋白可能通過參與CaM信號傳導通路調節神經可塑性，參與抑郁癥的發生。同時，CaMK Ⅱ是CaMK通路中重要的調控指標,Ca2+/CaM是主要激活CaMK Ⅱ的信號分子，促使CREB磷酸化，調節下游基因轉錄，CaMK在鈣信號轉導通路中起著軸心的作用。其不但受CaM的活化，而且受各種蛋白激酶的調節，蛋白激酶的磷酸化和去磷酸化是CaMK活化的開關。CaMK磷酸化可以進一步活化谷氨酸受體，活化其他離子通道，從而改變神經元的興奮性，活化下游的CREB以調節某種蛋白的合成。改變神經元的形態、突觸的數量以及結構。在突觸可塑性和學習中發揮著關鍵作用[13-15]。在腦組織中，CaMK Ⅱ蛋白及基因的上調，提高了信號轉導通路活性，是治療抑郁癥的重要作用機制之一。

本研究結果顯示,抑郁癥模型組大鼠在曠場實驗中垂直水平總得分亦明顯低于對照組，強迫游泳實驗中的不動時間也明顯長于對照組，說明大鼠在慢性應激環境下，自主活動明顯減少。模型組大鼠海馬組織中CaM、 CaMK II蛋白及基因表達水平低于對照組，說明這些關鍵分子參與了抑郁癥行為學改變和神經元損傷的發生發展。RT-PCR實驗結果顯示,酸棗仁湯能降低模型組大鼠海馬CaMKⅡ的mRNA表達，提示其抗抑郁作用可能與抑制海馬神經元細胞凋亡，減少腦損傷有關。有研究表明CaMK Ⅱ可能通過參與鈣調蛋白通路調節神經可塑性，參與抑郁癥的發生。實驗結果表明酸棗仁湯可能對慢性應激導致抑郁的大鼠有一定的治療作用。 Western-blot實驗結果顯示,CaMK II蛋白表達無顯著性差異，據分析可能存在實驗條件下蛋白表達的時間不夠充分，因此未能顯示出差異。

酸棗仁湯治療28天后，大鼠在強迫游泳實驗的不動時間也明顯縮短，說明酸棗仁湯能增進抑郁癥大鼠空間學習和記憶能力，改善活動度和絕望狀態；大鼠海馬組織中CaM、CaMK II蛋白和CREB mRNA表達水平升高，說明酸棗仁湯有抗抑郁效應，其機制可能與激活海馬組織中 CaMK Ⅱ基因表達，進而促進 CaMK Ⅱ蛋白磷酸化，最終達到預防及治療抑郁證的作用。