短瓣金蓮花化學成分與抑菌活性相關性研究

趙波,李洪濤,李鞠,蘇連杰*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2.廊坊市中醫醫院，河北 廊坊 065000)

毛茛科金蓮花屬(TrolliusL.)植物金蓮花(TrolliuschinensisBunge)為多年生宿根草本植物，其花味苦、性寒、氣芳香，具有清熱解毒、止腐愈傷等功效，主治刃傷、瘡殤多膿及咽喉腫痛等[1-2]。現代藥學研究和臨床應用表明，金蓮花主要用于上呼吸道感染、咽炎、扁桃體炎和支氣管炎[3]，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤和抗氧化等活性，并在2003年被選為預防嚴重急性呼吸道綜合征(SARS)疾病中的復合處方藥物之一。由于金蓮花所具有的良好生物活性及廣泛應用，使其野生資源匱乏并遭到破壞，因此急需尋找其替代源藥材，以拓展金蓮花藥材來源[4]。

短瓣金蓮花(TrolliusledebouriReichb.)為金蓮花同屬植物，主要分布于黑龍江省及內蒙古東北部，在西伯利亞東部及遠東地區也有分布，資源比較豐富。目前，已有學者對短瓣金蓮花進行了初步化學研究，分離得到黃酮類、有機酸類和甾醇類等化合物，并進行了初步活性研究，發現其同樣具有抗病毒、抗炎及抗氧化等生物活性[5]。筆者前期的研究工作表明，短瓣金蓮花與金蓮花的化學成分相當。為進一步確定短瓣金蓮花能否替代金蓮花成為一種安全、有效的臨床新藥源，本研究對短瓣金蓮花進行了體內外抑菌活性研究，并初步探討了其抑菌活性與化學成分的相關性。

1 儀器與材料

B-L系列分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；HH-S恒溫水浴鍋(江蘇金壇縣醫療儀器廠)；DHP-9162型電熱恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)；classⅡTYPE B2無菌操作臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、沙門氏菌和志賀氏痢疾桿菌(黑龍江中醫藥大學微生物實驗中心提供)；蛋白胨、瓊脂粉和氯化鈉(北京奧博星生物技術有限責任公司)；胰酶提取物；頭孢氨芐(批準文號：H11020463);金蓮花片(批準文號：Z13020456)。

昆明種小鼠，體質量(20±2.0)g，雌雄各半，清潔級，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SYXK黑2015001。

短瓣金蓮花和金蓮花藥材采自大興安嶺加格達奇，經黑龍江中醫藥大學蘇連杰教授鑒定為TrolliusledebouriReichb.和TrolliuschinensisBunge。

葒草苷和牡荊苷單體自制，經HPLC測定純度為99.98%。

2 方法與結果

2.1 體外抑菌試驗

2.1.1 供試品的制備

精密稱取干燥至恒重的短瓣金蓮花和金蓮花，70%乙醇回流提取，合并提取液減壓回收至無醇味，得總提取物。上大孔樹脂，用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%梯度乙醇洗脫，減壓回收洗脫液，用無菌水稀釋至相當于生藥量1 g/ml溶液，并按2、4、8、16倍稀釋成4個濃度。

2.1.2 藥敏紙片的制備

用打孔器將普通定性濾紙片用打孔器打成若干直徑為6 mm的圓形紙片，置于干燥潔凈的小錐形瓶中，封口，放入高壓蒸氣滅菌鍋中，經121 ℃高壓滅菌30 min，放冷，干燥。分別取干燥后的不同供試樣品0.2 g，用水溶解至濃度為20 μg/mL，并按倍比稀釋法稀釋成5個不同的濃度，將濾紙片放入溶劑中，反復吸取，晾干，直至將溶劑吸干，用紫外燈照射滅菌10～15 min，備用。

2.1.3 培養基的制備

制備瓊脂培養基。精密稱取胰酶提物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g,向燒杯中依次加入蛋白胨、胰酶提物、氯化鈉，加入1 000 mL蒸餾水，將燒杯放在加有石棉網的電爐上加熱，邊攪拌邊加入1.2%的瓊脂粉，加熱至微沸透明。并補足由于蒸發而失掉的水分，用4%的NaOH調節pH值至7.2～7.4，過濾，均勻分裝于500 mL錐形瓶中，然后放入121 ℃高壓滅菌30 min，取出趁熱倒入經過高壓滅菌的培養皿中，厚度約3～5 mm，冷卻凝固，備用。

2.1.4 菌懸液的制備

分別將菌株先接種于平板，在37 ℃培養箱中培養24 h后，挑選出各個菌株的典型菌落接種于25 mL瓊脂培養基中，置37 ℃培養箱中培養18～24 h，取1 mL制備菌液用無菌生理鹽水(0.9%)以10倍稀釋法依次進行稀釋，與麥氏比色管對比，調整其濁度至0.5麥氏比濁標準(即1.5×108cfu/mL)，備用。

2.1.5 抑菌活性的測定

采用濾紙片擴散法，用無菌移液管吸取稀釋好的菌懸液0.1 mL，置于培養皿中央，倒入適量的瓊脂培養液使菌懸液涂布均勻。用無菌鑷子夾取含藥濾紙片貼在培養基的表面，同時以含藥量為0.02 mg/mL的頭孢氨芐細菌藥敏試紙為陽性對照，以無菌雙蒸水浸泡過的濾紙片為陰性對照。將培養基放入37 ℃培養箱中培養24 h后取出觀察抑菌圈，并用游標卡尺測量抑菌圈的大小，結果以毫米(mm)表示，并以此判斷不同濃度供試品對供試菌的抑菌效果，每種不同濃度的供試品分別做3組平行對照，結果取平均值。具體見表1和表2。

注：與空白組比較，P<0.05，P<0.01，P<0.001。

注：與空白組比較，P<0.05，P<0.01，P<0.001。

表1及表2結果表明，與空白組比較，短瓣金蓮花與金蓮花總提物及不同洗脫部位對金黃色葡萄球菌等5種細菌均有不同程度的抑制作用，且以總提取物的抑菌效果最好；黃酮類單體化合物葒草苷和牡荊苷除對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌無抑菌作用，對其他三種細菌均有較好的抑菌效果。說明短瓣金蓮花與金蓮花抑菌效果相當。

2.2 體內抑菌試驗

2.2.1 感染菌液的制備

按“2.1.4”項操作，培養金黃色葡萄球菌，并將菌液按照麥氏計數法制成1011、1010、109、108、107、106、105、104cfu/mL濃度的菌液。

2.2.2 MLD(最小致死量)的確定

取體質量18～22 g的小鼠30只，分為6組，每組5只。分別腹腔注射不同濃度的細菌溶液(金黃色葡萄球菌)，注射量為0.5 mL/只，觀察小鼠在4天內的死亡情況，得到最小致死量(MLD)，即感染后引起小鼠100%死亡率的菌液濃度。結果見表3，結果表明金黃色葡萄球菌對小鼠的最小致死量為1011cfu/mL。正式實驗時，選定引起小鼠死亡率達80%～100%死亡的菌液濃度進行感染，即金黃色葡萄球菌為1010cfu/mL。

表3金黃色葡萄球菌對小鼠MLD的測定

組別菌液濃度(cfu/mL)劑量(ml/只)動物數(只)死亡數(只)死亡率(%)11×1070.5500 21×1080.55240.031×1090.55360.041×10100.55480.051×10110.555100.061×10120.555100.0

2.2.3 對小鼠感染致死性金黃色葡萄球菌的保護作用

取雌雄各半昆明種小白鼠90只，分為正常組、模型對照組(蒸餾水20 mL/kg)、金蓮花片組(2.4 g/kg)和70%乙醇提取短瓣金蓮花及金蓮花總提取物低劑量(0.12 g/kg)、中劑量(0.24 g/kg)、高劑量(0.48 g/kg)組。每日給小鼠灌胃1次，連續3天。第3天給藥后1 h腹腔注射最小致死量的細菌懸液0.5 mL/只作致死性攻擊，感染小鼠后，每小時觀察小鼠死亡情況，計算48 h小鼠死亡數，計算死亡率。結果見表4。

表4結果表明，模型對照組小鼠死亡率高達90.0%，與模型對照組比較，陽性對照組小鼠死亡率40.0%，體內抗菌療效顯著。短瓣金蓮花與金蓮花總提取物3個劑量組小鼠死亡率明顯低于模型對照組(P<0.05)，并有一定劑量依賴關系。

表4短瓣金蓮花提取物對感染小鼠死亡率的影響

組別劑量(g/kg)動物數(只)死亡數(只)死亡率(%)正常組—1000 模型對照組—10990.0金蓮花片組2.410440.0金蓮花總提組(低)0.1210760.0金蓮花總提組(中)0.2410650.0金蓮花總提組(高)0.4810440.0短瓣金蓮花總提組(低)0.1210880.0短瓣金蓮花總提組(中)0.2410770.0短瓣金蓮花總提組(高)0.4810550.0

3 小結

體外抗菌實驗結果表明，短瓣金蓮花及金蓮花對五種實驗細菌均有不同程度的抗菌作用，尤以短瓣金蓮花與金蓮花總提取物的抗菌效果最好，葒草苷和牡荊苷對大腸桿菌及綠膿桿菌抑菌作用比較明顯，對其他實驗菌作用不明顯。推測金蓮花屬植物抗菌活性可能與其總黃酮類成分中各單體協同抑菌作用有關。

體內抗菌實驗研究表明，與模型組比較，陽性對照組和金蓮花及短瓣金蓮花總黃酮3個劑量組對感染致死量的金黃色葡萄球菌小鼠均有一定的體內保護作用(P<0.05)，并有一定劑量依賴關系。結果顯示，金蓮花與短瓣金蓮花的抗菌活性相當。