DDR2血管內(nèi)皮細(xì)胞條件性基因敲除小鼠的復(fù)制、鑒定及表型分析*

王婷婷，卜歆，李金奎，王娜，邱意開(kāi)，岳振生，蘇金，張淑雅

[1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（生物化學(xué)與分子生物學(xué)系），寧夏 銀川 750004；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物教研室，陜西 西安 710032；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 急診科，寧夏 銀川 750004]

膠原的盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受 體2（discoidin domain receptor 2, DDR2）是一種位于細(xì)胞膜的酪氨酸蛋白激酶受體，由胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成，胞外盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域被膠原識(shí)別并激活，進(jìn)而介導(dǎo)盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域發(fā)生二聚化，觸發(fā)胞內(nèi)催化結(jié)構(gòu)域的酪氨酸殘基發(fā)生自磷酸化[1]。磷酸化的酪氨酸激酶介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)膠原向細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞[2]。DDR2 高表達(dá)于激活狀態(tài)的血管內(nèi)皮細(xì)胞（例如，心臟瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過(guò)程[3]，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞[4]）。前期研究發(fā)現(xiàn)，DDR2 自發(fā)全身性突變?nèi)笔∈竽[瘤血管新生障礙，能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。另有文獻(xiàn)[5]報(bào)道，DDR2 全身性敲除促進(jìn)小鼠肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，提示DDR2 在生理和病理性血管新生中扮演十分重要的調(diào)控作用，但對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中DDR2 對(duì)血管新生的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。為深入研究血管內(nèi)皮細(xì)胞中DDR2 在血管新生中的作用及分子機(jī)制，本研究設(shè)計(jì)基于同源重組理論，利用胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell, ES cell）（ES 細(xì)胞）打靶及顯微注射技術(shù)，復(fù)制DDR2flox/flox小鼠，利用Cre/LoxP 系統(tǒng)復(fù)制DDR2在血管內(nèi)皮細(xì)胞可誘導(dǎo)性條件性基因敲除小鼠（DDR2flox/flox，Cdh5-Cre/ERT2），可以選擇性地在小鼠發(fā)育的不同時(shí)間誘導(dǎo)敲除血管內(nèi)皮細(xì)胞中的DDR2，希望為深入研究DDR2 在生理性及病理性血管新生中的作用提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6N 小鼠購(gòu)自南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院，Cdh5-Cre/ERT2小鼠由空軍軍醫(yī)大學(xué)韓驊教授饋贈(zèng)，所有實(shí)驗(yàn)小鼠均按照無(wú)特定病原級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。

1.1.2 試劑與儀器 基因組提取試劑盒（北京天根生物有限公司），PCR 引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]，PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司），瓊脂糖（上海碧云天生物技術(shù)公司），他莫昔芬（美國(guó)Sigma 公司），玉米油（美國(guó)Sigma 公司），小鼠CD146免疫磁珠（德國(guó)Miltenyi 公司，130-092-007），小號(hào)磁力柱（德國(guó)Miltenyi 公司，130-042-201），ECM 培養(yǎng)基（美國(guó)Scien Cell 公司，1001），DMEM（美國(guó)Hyclone 公司），IV 型膠原酶（美國(guó)Sigma 公司，C5138），100 μm 細(xì)胞篩網(wǎng)（美國(guó)BD 公司，352360），DDR2 抗體（美國(guó)R&D公司，MAB2538）。MACSTM 全自動(dòng)組織處理器（德國(guó)Miltenyi 公司），低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Eppendorf 公司），Olympus X71 倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司），F(xiàn)C500 流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman coulter 公司）。

1.2 方法

1.2.1 DDR2 條件性基因敲除（conditional gene knockout, CKO）策略 小鼠DDR2基因全長(zhǎng)116.64 kb，包含17 個(gè)外顯子，編碼的蛋白質(zhì)由854 個(gè)氨基酸組成，本策略（見(jiàn)圖1）是在第2 個(gè)外顯子的下游內(nèi)含子區(qū)插入FRT-Neo-FRT-LoxP 元件，在第3 個(gè)外顯子的下游的內(nèi)含子區(qū)插入另外一個(gè)LoxP 位點(diǎn)，利用Cre 重組酶特異識(shí)別34 bp 的部分回文的LoxP 位點(diǎn)之間的序列，發(fā)生特異性地重組或刪除。導(dǎo)致第3 個(gè)外顯子區(qū)域的1.1 kb 序列將被Cre/LoxP 系統(tǒng)切除，形成移碼突變而阻止蛋白質(zhì)的正常翻譯。

圖1 DDR2 CKO 策略圖

1.2.2 DDR2 CKO打靶載體的構(gòu)建如圖2所示，含有靶基因的細(xì)菌人工染色體（bacterial artifical chromosome, BAC）克隆購(gòu)自Invitrogen，從BAC 載體擴(kuò)增5'-同源臂、3'-同源臂和DDR2 基因的靶向區(qū)域，然后將這3 個(gè)片段連接到具有第1 個(gè)LoxP 和FRTNeo-FRT 的第2 個(gè)LoxP 元件的載體中。在電穿孔進(jìn)入ES 細(xì)胞之前，通過(guò)PCR、酶消化和測(cè)序確認(rèn)靶向載體。PGK/EM7-NeoR 盒作為ES 細(xì)胞靶向步驟的陽(yáng)性選擇標(biāo)記，將Flox 表達(dá)菌株與floxed 小鼠雜交，或在ES 細(xì)胞階段表達(dá)Flpe 來(lái)除去。TK 是ES 細(xì)胞靶向步驟的陰性選擇標(biāo)記，隨機(jī)插入靶基因的細(xì)胞將死于細(xì)胞毒性。

圖2 DDR2 CKO 打靶載體結(jié)構(gòu)

1.2.3 ES 細(xì)胞克隆篩選及囊胚注射 將線(xiàn)性化的打靶載體，電轉(zhuǎn)到ES 細(xì)胞進(jìn)行打靶，通過(guò)長(zhǎng)片段PCR 及脫氧核苷酸（DNA）印跡法篩選出中靶克隆，將其注射于囊胚，并移植于受體小鼠子宮，得到嵌合體小鼠（嵌合率＞50%）。

1.2.4 DDR2flox/flox小鼠的復(fù)制 根據(jù)毛色篩選嵌合率在50%及以上的雄性鼠，將其與Flper 小鼠配繁一代，去除Neo 抗性基因，排除Neo 基因?qū)π∈蟊硇头治龅母蓴_，以獲得DDR2flox/flox小鼠。

1.2.5DDR2基因在血管內(nèi)皮細(xì)胞可誘導(dǎo)性條件性基因敲除小鼠的獲得 篩選DDR2flox/+小鼠與Cdh5-Cre/ERT2小鼠雜交，并通過(guò)子代自交獲得DDR2 在血管內(nèi)皮細(xì)胞可誘導(dǎo)性條件性基因敲除的純合子小鼠DDR2i?EC（DDR2flox/flox小鼠，Cdh5-Cre/ERT2）。

1.2.6 血管內(nèi)皮細(xì)胞DDR2基因誘導(dǎo)敲除 在小鼠4周齡時(shí)，給予DDR2i?EC小鼠與同窩野生對(duì)照組（wild type, WT）小鼠腹腔注射他莫昔芬，劑量為66 mg/kg，連續(xù)給藥5 d。

1.2.7 肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞的分離、鑒定及DDR2 敲除效率分析 在小鼠8周齡時(shí)，用免疫磁珠法分離肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞純度，應(yīng)用定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）及蛋白免疫印跡法檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞DDR2 的表達(dá)。

1.2.8 肝臟病理切片HE 染色、天狼星紅染色及Masson 三色染色 在小鼠3月齡時(shí)，解剖DDR2i?EC小鼠的肝臟（選取同窩DDR2flox/flox小鼠肝臟為對(duì)照，WT），進(jìn)行石蠟包埋，切片，通過(guò)HE 染色、天狼星紅染色、Masson 染色及免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝臟的病理變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采 用Image Pro plus 6.0 和GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DDR2 CKO 打靶載體

所有質(zhì)粒均經(jīng)PCR 鑒定，終載體中FRT 位點(diǎn)至第2 個(gè)LoxP 位點(diǎn)間片段均存在。電轉(zhuǎn)后得到藥物抗性ES 細(xì)胞克隆6 個(gè)，分別經(jīng)長(zhǎng)片段PCR 及DNA blotting 鑒定，最終篩選出4 個(gè)陽(yáng)性克隆。

2.2 嵌合體小鼠及DDR2 flox 小鼠

圖3 DDR2 CKO 小鼠基因鑒定結(jié)果

如圖3所示，顯微注射后得到由基因敲除ES 細(xì)胞和供體胚胎細(xì)胞共同發(fā)育而來(lái)的嵌合小鼠。挑選嵌合率在50%及以上的成熟雄性嵌合體小鼠與Flper 小鼠配繁一代后再與野生型B6 小鼠進(jìn)行交配，得到的F1 代小鼠，經(jīng)PCR 鑒定基因型后獲得雜合體（基因型表示為：Fln/WT）小鼠，218 與221 為雜合子小鼠，用于F0 代交配。

2.3 DDR2 血管內(nèi)皮細(xì)胞可誘導(dǎo)性條件性基因敲除小鼠的繁育及鑒定結(jié)果

DDR2flox/flox小鼠與Cdh5-Cre/ERT2小鼠雜交，對(duì)后代自交后獲得的小鼠進(jìn)行基因型鑒定，成功獲得DDR2 血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)性條件性基因敲除小鼠DDR2i?EC（DDR2flox/flox，Cdh5-Cre/ERT2）。見(jiàn)圖4。

2.4 血管內(nèi)皮細(xì)胞DDR2 基因誘導(dǎo)敲除效率

用免疫磁珠法分離提取肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞，純度達(dá)到88.4%（見(jiàn)圖5A）。與對(duì)照組（WT）比較，DDR2在DDR2i?EC小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞mRNA 表達(dá)下降＞95%（WT組為（1.032±0.092），DDR2i?EC組為（0.053± 0.025），t=6.246，P=0.002）（見(jiàn)圖5B）。與WT 組比較，DDR2 在DDR2i?EC小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中的蛋白表達(dá)下降＞95%（DDR2/β-actin 的比值在WT 組為（0.568±0.023），DDR2i?EC組為（0.020±0.010），t=8.839，P=0.001）（見(jiàn)圖5C、D），證明DDR2flox/flox和 Cdh5-Cre/ERT2能夠高效敲除血管內(nèi)皮細(xì)胞上的DDR2，DDR2i?EC小鼠復(fù)制成功。

2.5 DDR2i ?EC 小鼠肝臟表型分析

3月齡DDR2i?EC小鼠肝臟呈現(xiàn)自發(fā)纖維化。肝臟病理切片HE 染色（見(jiàn)圖6A）顯示，DDR2i?EC小鼠肝血竇結(jié)構(gòu)排列異常，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，天狼星紅染色 （圖6B、C）陽(yáng)性區(qū)域與WT 組比較，DDR2i?EC組增加 （7.089±0.9852）倍（t=5.040，P=0.003）。Masson 染色 陽(yáng)性區(qū)域顯示，與WT組比較，DDR2i?EC組增加（5.499± 0.9804）倍（t=6.480，P=0.001）（見(jiàn)圖6D、E）。上述 結(jié)果均表明DDR2i?EC小鼠肝臟膠原纖維沉積增多，尤其沉積在血管周?chē)崾狙軆?nèi)皮細(xì)胞中DDR2 缺失導(dǎo)致肝臟發(fā)生自發(fā)性纖維化病變。

圖4 DDR2i ?EC 小鼠基因型的鑒定結(jié)果

圖5 肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞純度及DDR2 表達(dá)

圖6 DDR2i ?EC 小鼠呈現(xiàn)自發(fā)性肝纖維化

3 討論

作為細(xì)胞外基質(zhì)膠原（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及X 型）的DDR2，屬于膜表面受體型蛋白酪氨酸激酶[6]，膠原識(shí)別并激活DDR2，參與細(xì)胞增殖、遷移及細(xì)胞外基質(zhì)的重塑[7]。主要在骨骼[8-9]、心臟[10]、皮膚[11]、腎[12]、肺[13-14]和卵巢[15]中高表達(dá)。近年來(lái)，DDR2 在血管新生中的作用受到重視，筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)DDR2 高表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤間質(zhì)中DDR2 缺失能抑制腫瘤血管新生，抑制DDR2 可抑制肺纖維化過(guò)程中VEGF 的分泌而抑制病理性血管新生[16]，提示DDR2 在生理性及病理性血管新生中扮演中重要角色。但血管內(nèi)皮細(xì)胞中DDR2 的作用尚未見(jiàn)報(bào)道，深入研究DDR2 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用具有重要意義。本研究用基因打靶技術(shù)復(fù)制DDR2flox/flox小鼠，并將其與血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性Cre/ERT2小鼠（Cdh5 Cre/ERT2）進(jìn)行交配，得到DDR2flox/flox和Cdh5Cre/ERT2小鼠，然后給予他莫昔芬誘導(dǎo)Cre 酶的活性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，在特定時(shí)間特異性地敲除血管內(nèi)皮細(xì)胞中DDR2，分離肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)qPCR 及蛋白免疫印跡法檢測(cè)DDR2 敲除效率，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中DDR2 的敲除效率高達(dá)90%以上，證明成功復(fù)制血管內(nèi)皮細(xì)胞DDR2誘導(dǎo)性條件性基因敲除小鼠，為后續(xù)深入研究DDR2 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。在表型分析中發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞DDR2條件性基因敲除后會(huì)誘發(fā)小鼠自發(fā)的肝纖維化，筆者將在后續(xù)深入研究血管內(nèi)皮細(xì)胞DDR2 缺失導(dǎo)致肝纖維化的機(jī)制。

條件性基因敲除小鼠是將某個(gè)基因修飾定位于某些特定類(lèi)型的細(xì)胞或小鼠發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因打靶技術(shù)[17]。目前條件性基因打靶主要使用來(lái)源于大腸桿菌P1 噬菌體的Cre/LoxP 系統(tǒng)。Cre/LoxP 系統(tǒng)主要由兩部分組成，Cre 重組酶和Cre/LoxP 位點(diǎn)。Cre/LoxP 誘導(dǎo)系統(tǒng)目前是最先進(jìn)的工具之一，不僅用于特定的細(xì)胞類(lèi)型，而且是在特定的時(shí)間敲除目的基因[18]。本研究引用血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性Marker 基因Cdh-5（又稱(chēng)為VE-Cadherin）調(diào)控Cre 的啟動(dòng)子[19]，通過(guò)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cre 重組酶的表達(dá)模式，可以在血管內(nèi)皮細(xì)胞中完成特異性基因敲除[20]。在可誘導(dǎo)性條件性敲除的這個(gè)系統(tǒng)中，Cre 蛋白質(zhì)被融合到一種突變的雌激素受體（ER）中，在未誘導(dǎo)的細(xì)胞中，Cre-ER 被隔離在細(xì)胞質(zhì)中，不能發(fā)揮作用[21]。但是在給予他莫昔芬（是ER 突變體的配體）后，ER 和Cre 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，Cre 酶識(shí)別loxp 位點(diǎn)的目的基因DDR2，在loxp 位點(diǎn)上將目的基因DDR2切除，使DDR2 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中不能轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而在內(nèi)皮細(xì)胞中特異性敲除DDR2，可誘導(dǎo)性敲除的優(yōu)勢(shì)在于可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行誘導(dǎo)敲除。

在小鼠的表型分析中發(fā)現(xiàn)，DDR2flox/flox和Cre/ERT2小鼠在給予他莫昔芬誘導(dǎo)后出現(xiàn)自發(fā)性肝纖維化，這是一個(gè)令人興奮的現(xiàn)象，提示血管內(nèi)皮細(xì)胞中的DDR2在防御肝纖維化過(guò)程中扮演重要角色。文獻(xiàn)報(bào)道DDR2全身敲除小鼠慢性四氯化碳導(dǎo)致的肝纖維化模型中，DDR2 缺失導(dǎo)致肝纖維化加重[22]。要闡明血管內(nèi)皮細(xì)胞中DDR2 在肝纖維化中的作用機(jī)制需要DDR2 內(nèi)皮細(xì)胞條件性基因敲除小鼠，本研究復(fù)制的DDR2flox/flox和Cdh5-Cre/ERT2小鼠將為后續(xù)深入研究奠定基礎(chǔ)，具有非常重要的意義。