循環(huán)血TLR-4、TGF-β1表達(dá)水平與HBV相關(guān)性肝硬化患者病情程度的相關(guān)性分析

陳芳，喻雪琴，戢敏，陳星，梅怡晗，梅小平

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 感染科，四川 南充 637000；2.首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069）

機(jī)體感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）后，大部分HBV 在機(jī)體免疫作用下被清除，少部分HBV 逃避機(jī)體免疫防御系統(tǒng)可致無癥狀攜帶狀態(tài)、急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）、HBV 相關(guān)性肝硬化、肝衰竭等，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球30%肝硬化患者由HBV 感染所致，我國(guó)60%肝硬化由HBV 感染所致[1]。肝硬化按新Child-Pugh 分級(jí)分為A、B、C 3 級(jí)[2]，目前反映肝損程度、肝纖維化或肝硬化程度的指標(biāo)較多，但近年來，Toll 樣受體4（toll-like receptor 4, TLR-4）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor β1, TGF-β1）在HBV 相關(guān)肝硬化發(fā)生、發(fā)展中的作用越來越受到重視，本研究通過檢測(cè)HBV 攜帶者、CHB 患者及不同Child-Pugh 分級(jí)的HBV相關(guān)性肝硬化患者循環(huán)血中TGF-β1、TLR-4水平，并與循環(huán)血ALT、HBV DNA 載量做相關(guān)性分析，探討TGF-β1、TLR-4 在HBV 相關(guān)性肝硬化發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選 取2016年1月—2017年12月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的HBV 攜帶者25 例（HBV 攜帶組），CHB 患者50 例（CHB 組），HBV 相關(guān)性肝硬化患者139 例（HBV 相關(guān)性肝硬化組），選取同期25 例健康體檢者為對(duì)照（健康對(duì)照組）。HBV 相關(guān)性肝硬化組按Child-Pugh 分級(jí) 為A 級(jí)64 例、B 級(jí)48 例、C 級(jí) 27 例。觀察研究對(duì)象循環(huán)血TGF-β1、TLR-4 表達(dá)水平。研究患者在性別、年齡上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷標(biāo)準(zhǔn)參照慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）[1]；②患者均知情同意；③患者均未接受免疫調(diào)節(jié)及抗病毒治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他類型的嗜肝病毒性肝炎、自身免疫性疾病、血吸蟲病、酒精性肝病等其他因素導(dǎo)致的肝損害；②合并或單獨(dú)細(xì)菌、真菌及其他非嗜肝病毒感染所致的肝損害；③合并其他嚴(yán)重全身性疾病或精神病患者；④妊娠或哺乳期婦女。

1.2 檢測(cè)方法

采用酶聯(lián)免疫吸附試 驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）檢測(cè)各研究對(duì)象循環(huán)血中TLR-4、TGF-β1水平（寧波美康生物科技股份有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)循環(huán)血清HBV DNA 水平（上海之江生物科技股份有限公司）；ADVIA 2400 全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑 （德國(guó)西門子公司）檢測(cè)肝功能指標(biāo)，所有試劑在有效期內(nèi)使用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組循環(huán)血TLR-4、TGF-β1 表達(dá)水平比較

各組循環(huán)血TLR-4、TGF-β1表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HBV 攜帶者組循環(huán)血TLR-4、TGF-β1表達(dá)水平與健康對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），HBV 相關(guān)性肝硬化組TLR-4、TGF-β1表達(dá)水平較健康對(duì)照組、HBV 病毒攜帶組、CHB 組水平升高（P＜0.05）。見表1。

2.2 不同病情程度HBV 相關(guān)性肝硬化患者循環(huán)血中TLR-4、TGF-β1 表達(dá)水平

在HBV 相關(guān)性肝硬化患者中，Child-Pugh A、B、C 級(jí)3 者循環(huán)血TLR-4、TGF-β1表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Child-Pugh C 級(jí)TLR-4、TGF-β1水平最高，隨著肝損傷或肝纖維化程度加重，循環(huán)血TLR-4、TGF-β1表達(dá)水平升高。見表2。

表1 各組循環(huán)血TLR-4、TGF-β1 表達(dá)水平比較 （±s）

表1 各組循環(huán)血TLR-4、TGF-β1 表達(dá)水平比較 （±s）

注：?與HBV 相關(guān)性肝硬化組比較，P＜0.05。

組別 n TLR-4/（pg/ml） TGF-β1/（ng/ml）健康對(duì)照組 25 1.09±0.27? 1.49±0.21?HBV 攜帶組 25 1.18±0.23? 1.53±0.19?CHB 組 50 6.71±0.69? 6.15±0.82?HBV 相關(guān)性肝硬化組 139 32.89±4.05 48.97±5.12 F 值 81.980 68.170 P 值 0.000 0.000

表2 不同病情程度HBV 相關(guān)性肝硬化患者循環(huán)血 TLR-4、TGF-β1 表達(dá)水平比較 （±s）

表2 不同病情程度HBV 相關(guān)性肝硬化患者循環(huán)血 TLR-4、TGF-β1 表達(dá)水平比較 （±s）

組別 n TLR-4/（pg/ml） TGF-β1/（ng/ml）Child-Pugh A 級(jí) 64 29.28±3.43 44.20±4.36 Child-Pugh B 級(jí) 48 34.55±3.62 49.36±4.38 Child-Pugh C 級(jí) 27 39.28±4.17 54.59±5.48 F 值 41.200 56.320 P 值 0.000 0.000

2.3 HBV 相關(guān)性肝硬化組循環(huán)血中TLR-4、TGF-β1 表達(dá)水平與HBV DNA 載量、ALT 水平間的相關(guān)性

HBV 相關(guān)性肝硬化組循環(huán)血TLR-4、TGF-β1水平與HBV DNA 載量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.497 和-0.581，均P=0.000），與ALT 水平呈正相關(guān)（r=0.572 和0.619，均P=0.000）。

2.4 各組循環(huán)血TLR-4、TGF-β1 表達(dá)水平的相關(guān)性

HBV 相關(guān)性肝硬化患者循環(huán)血TGF-β1表達(dá)水平與TLR-4 水平呈正相關(guān)（r=0.736，P=0.000）。見表3。

表3 各組循環(huán)血TLR-4 與TGF-β1 表達(dá)水平的相關(guān)性

3 討論

HBV 感染是全球性公共衛(wèi)生問題之一，HBV 感染后可形成CHB、肝組織纖維化、HBV 相關(guān)性肝硬化或肝細(xì)胞癌[3-4]，威脅著人們健康。機(jī)體感染HBV后并非直接導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，近年來研究發(fā)現(xiàn)，固有免疫在HBV 感染及相關(guān)性肝病的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的調(diào)控作用，在很大程度上影響著HBV 感染后的臨床類型及預(yù)后。目前有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，TLRs 是模式識(shí)別受體家族中最重要的一類受體，其通過識(shí)別病毒、細(xì)菌、真菌等病原體的相關(guān)結(jié)構(gòu)而在機(jī)體固有免疫中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)TLRs 受體不少于10 種，1988年HASHIMOTO 等研究果蠅胚胎發(fā)育期時(shí)首次發(fā)現(xiàn)并成功克隆出Toll 基因之一的TLR-4 受體，它屬于Ⅰ型跨膜蛋白，主要識(shí)別細(xì)菌內(nèi)毒素（LPS）。TLR-4 屬于細(xì)胞表面TLRs，對(duì)人體固有免疫應(yīng)答有重要調(diào)控作用，主要分布在肝臟的肝星狀細(xì)胞（HSC）膜上，發(fā)揮識(shí)別LPS 和DAMPs 的作用，并上調(diào)活化HSCs 標(biāo)志蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)水平，抑制降解膠原蛋白的基質(zhì)蛋白酶-2（MMP-2）活性，促進(jìn)HSCs 活化轉(zhuǎn)化為成肌纖維細(xì)胞，膠原纖維蛋白原生成增加，肝纖維化的發(fā)生與沉積。王惠等[6]研究肝硬化患者外周血時(shí)發(fā)現(xiàn)，LPS 可上調(diào)TLR-4 表達(dá)水平，可能參與肝組織纖維化或肝硬化的發(fā)生、發(fā)展。

肝臟組織中TGF-β1是各種TGF-β 異構(gòu)體中最主要的存在形式，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受損后釋放的TGF-β1是啟動(dòng)鄰近靜息態(tài)HSC 激活和轉(zhuǎn)化的初始信號(hào)之一，也是是最強(qiáng)的促肝纖維化的細(xì)胞因子之一。TGF-β是一組新型的細(xì)胞因子，研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β 是由至少30 多種細(xì)胞因子組成的細(xì)胞因子超家族，TGF-β 分為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β33 種 類 型。TGF-β1屬TGF-β 超家族成員之一，是一種具有多重生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、凋亡的功能，參與調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的產(chǎn)生、降解、ECM 沉著，參與肝組織纖維化的再生和修復(fù)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)，是介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷及肝組織纖維化發(fā)生、發(fā)展的最關(guān)鍵細(xì)胞因子之一，同時(shí)在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中具有活化HSC，促進(jìn)膠原基因表達(dá)，直接導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的合成與沉積增加，同時(shí)通過抑制纖溶酶原的激活抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解；促進(jìn)成纖維細(xì)胞趨化和轉(zhuǎn)化、促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡等多種作用[7]。有學(xué)者研究表明，正常肝組織中一般不或僅少量地分泌TGF-β1，但在HBV 相關(guān)性肝硬化患者循環(huán)血中高表達(dá)，它可通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡、抑制肝細(xì)胞再生及促進(jìn)肝細(xì)胞外基質(zhì)的形成來誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生，誘導(dǎo)、促進(jìn)、參與肝硬化的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。

本研究結(jié)果顯示，HBV 攜帶者組循環(huán)血TLR-4、TGF-β1水平與健康對(duì)照組比較無差異，循環(huán)血TLR-4、TGF-β1表達(dá)水平隨HBV 相關(guān)性肝病患者病情加重而升高，在HBV 相關(guān)性肝硬化患者中表達(dá)水平最高，其TLR-4、TGF-β1表達(dá)水平較健康對(duì)照組、HBV 病毒攜帶組、CHB 組水平升高，4 者間比較有差異，HBV相關(guān)性肝硬化組TLR-4、TGF-β1表達(dá)水平較CHB組增加，兩者比較有差異。本研究結(jié)果顯示，TLR-4、TGF-β1在HBV 相關(guān)性肝硬化患者中高表達(dá)，這可能與機(jī)體HBV 感染后的肝組織炎癥及纖維化程度較高相關(guān)，提示TLR-4、TGF-β1的表達(dá)水平在一定程度反映HBV 感染者在CHB、HBV 相關(guān)性肝硬化的發(fā)生、發(fā)展中所起的作用。肝纖維化是CHB 向HBV 相關(guān)性肝硬化發(fā)展的一個(gè)中間過程，多種因素可誘發(fā)肝細(xì)胞損傷導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生，誘導(dǎo)大量促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生。其中TGF-β1一直被認(rèn)為是誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化的主要細(xì)胞因子[10]，參與誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化、分化與增殖及ECM 合成與沉積，最終導(dǎo)致ECM 合成與降解失衡，從而引起肝組織纖維化、HBV 相關(guān)性肝硬化的發(fā)生。魏卓等[11]研究表明，TLR-4、TGF-β1不能在正常肝組織中表達(dá)，在HBV 相關(guān)性肝病患者中也主要表達(dá)在肝細(xì)胞胞質(zhì)或少量地表達(dá)在肝細(xì)胞膜上，肝細(xì)胞核上不表達(dá)，且其在CHB 及其相關(guān)性肝硬化患者肝組織中存在共表達(dá)，在一定程度反映與肝組織纖維化、肝硬化的相關(guān)性。該研究結(jié)果提示，肝細(xì)胞感染HBV 后，可上調(diào)TLR-4 表達(dá)水平，誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生大量TGF-β1，激活肝星狀細(xì)胞，誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞增殖，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。趙秀娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)血TGF-β1在肝組織纖維化的各個(gè)階段中表達(dá)水平升高，且對(duì)照組與觀察組比較有差異。并隨著病理肝纖維化分期和肝組織纖維含量的增加，循環(huán)血TGF-β1表達(dá)水平升高，表明循環(huán)血TGF-β1水平與肝組織纖維化發(fā)展的階段性及肝纖維化程度的相關(guān)性與一致性。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，TLR-4 在健康對(duì)照組中幾乎不表達(dá)，在CHB 組及HBV 相關(guān)性肝硬化組的循環(huán)血中呈現(xiàn)高表達(dá)，且在HBV 相關(guān)性肝硬化組中的表達(dá)水平高于CHB 組，也在一定程度反映與肝纖維化的相關(guān)性。魯之中等[13]通過檢測(cè)CHB、HBV相關(guān)性肝硬化以及HBV 相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者循環(huán)血及肝組織的TLR-4、TGF-β1的表達(dá)水平變化發(fā)現(xiàn)，TLR-4、TGF-β1表達(dá)水平與肝組織炎癥及纖維化程度的一致性，也得出了與作者研究結(jié)果相似觀點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，在HBV 相關(guān)性肝硬化患者中，隨著肝損或肝纖維化程度加重，循環(huán)血TLR-4、TGF-β1表達(dá)水平升高，Child-Pugh C 級(jí)HBV 相關(guān)性肝硬化患者循環(huán)血TLR-4、TGF-β1水平最高，Child-Pugh A、B、C 級(jí)3 者比較有差異。本研究結(jié)果顯示，高水平表達(dá)的TLR-4、TGF-β1可能誘導(dǎo)參與、促進(jìn)肝膠原纖維的大量合成，抑制膠原纖維降解，導(dǎo)致HBV相關(guān)性肝組織纖維化及肝硬化的發(fā)生、發(fā)展，這與趙秀娟等[12]研究結(jié)果相似。另外，徐承俊等[14]通過檢測(cè)不同Child-Pugh 分級(jí)的HBV 相關(guān)性肝硬化患者循環(huán)血TLR-4、TGF-β1表達(dá)水平，也得出與作者相似的 結(jié)果。

本研究結(jié)果顯示，HBV 相關(guān)性肝硬化患者循環(huán)血TLR-4、TGF-β1水平與HBV DNA 載量呈負(fù)相關(guān)、與ALT 水平呈正相關(guān)。筆者認(rèn)為，HBV 持續(xù)存在是導(dǎo)致肝組織炎癥發(fā)生或持續(xù)的關(guān)鍵啟動(dòng)因子，HBV 通過多途徑來誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞持續(xù)活化與增殖，促進(jìn)TLR-4、TGF-β1水平高表達(dá)，從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，HBV 相關(guān)性肝硬化患者循環(huán)血TLR-4、TGF-β1水平與HBV DNA 載量呈負(fù)相關(guān)，這可能與HBV 相關(guān)性肝硬化患者HBV 感染時(shí)間長(zhǎng)，大量HBV 與肝細(xì)胞核結(jié)合，循環(huán)血中游離HBV 低水平表達(dá)，但肝組織纖維化持續(xù)發(fā)展，TLR-4、TGF-β1水平高表達(dá)，同時(shí)TLR-4、TGF-β1的高表達(dá)本身可激活肝細(xì)胞自身抗病毒機(jī)制與抑制HBV DNA 復(fù)制水平相關(guān)。另外，HBV DNA 低水平的持續(xù)存在，多途徑誘導(dǎo)激活HSC，導(dǎo)致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受損和纖維化的發(fā)生，也啟動(dòng)TLR-4、TGF-β1的活化與高水平表達(dá)，與李彩東等人研究結(jié)果相一致[15]。張香梅等[16]研究結(jié)果顯示，肝組織內(nèi)TGF-β1表達(dá)水平隨著HBV 相關(guān)性肝病患者循環(huán)血HBV DNA 載量的增加而高表達(dá)，顯示HBV 的存在與復(fù)制水平對(duì)CHB 患者肝纖維化的發(fā)生與形成關(guān)系密切。但王珍麗等[17]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1的表達(dá)水平與HBV DNA 載量無相關(guān)性。作者認(rèn)為，CHB 及相關(guān)性肝硬化患者循環(huán)血中TLR-4、TGF-β1水平與HBV DNA 載量的相關(guān)性仍有不同觀點(diǎn)，有待多中心、多區(qū)域、嚴(yán)標(biāo)準(zhǔn)等措施來進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究檢測(cè)HBV 感染及其相關(guān)性肝硬化患者循環(huán)血TLR-4、TGF-β1的表達(dá)水平并對(duì)其進(jìn)行分析，顯示TLR-4、TGF-β1在HBV 相關(guān)性肝硬化的發(fā)生、發(fā)展起重要調(diào)控作用。作者是從循環(huán)血分析TLR-4、TGF-β1在HBV 相關(guān)性肝硬化的表達(dá)水平變化，但未就肝組織中的TLR-4、TGF-β1水平表達(dá)與肝組織纖維化程度及循環(huán)血TLR-4、TGF-β1表達(dá)水平進(jìn)行比較，也未探討肝組織學(xué)的TLR-4、TGF-β1與HBV DNA 及肝纖維化程度的關(guān)系，因此，本研究探討肝纖維化發(fā)生機(jī)制存在一定的局限性。未來將擴(kuò)大樣本量，增加肝組織及外周血TLR-4、TGF-β1與HBV DNA 水平間關(guān)系，以及與肝組織纖維化程度關(guān)系的研究來予以驗(yàn)證。