一種無煙氣煙草制品秀爽的吸入毒理學評價

黃玉川，梁坤，趙巍，劉鍇，鄭怡，包毅，鄧永*

1 四川中煙工業有限責任公司，新型煙草制品中心，成都市錦江區成龍大道一段56號 610066；2 國家成都新藥安全性評價中心，成都市高新區高朋大道28號 610041

吸煙有害健康是一個不爭的事實，隨著各國公共場所禁煙令的出臺和實施，煙草行業尋求風險更低、環境煙氣少的新型煙草制品。鼻煙具備的健康、環保屬性吸引了越來越多的傳統卷煙消費者的關注。

傳統鼻煙是用發酵煙葉粉末加香料調制而成，以鼻吸用的無煙氣煙草制品。益德成鼻煙是在研磨極細的優質煙草粉末中，摻入麝香、冰片等名貴藥材或香草類物質，經過精細加工，并在封閉容器中陳化數年乃至數十年后才完成的一種深加工煙制物。寬窄?益德成秀爽（簡稱秀爽）是將傳統鼻煙與特種濾棒技術融合，打造的一款提神的無煙氣煙草制品，是通過口腔空吸、鼻腔嗅吸，達到清新口氣、醒腦、提神、通竅、緩解焦慮和疲勞之功效。本研究按照國家食品藥品監督管理總局《藥物非臨床研究質量管理規范》（2017年9月生效）[1]，經濟合作組織 OECD Principles of Good Laboratory Practice（as revised in 1997）ENV/MC.CHEM（98）17[2]要 求，對秀爽進行大鼠經口鼻吸入毒理學評價，觀察秀爽對大鼠的生長發育及代謝的影響，為評價日常使用的安全性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

SPF級SD大鼠120只，體重120～180 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供；寬窄?益德成秀爽（正紅）（W0545，中國）；戊巴比妥鈉（Sigma，美國）；復方托吡卡胺滴眼液（美多麗，日本）；HRH-MNE3026小動物單濃度口鼻暴露系（北京慧榮，中國）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組：120只健康SD大鼠，雌雄各半，適應性喂養5天，采用PRISTIMA 7.2.0 版數據系統根據大鼠體重分性別隨機分4組：對照組，W0545低、中、高劑量組，每組30只。

1.2.2 劑量設計：成人每日推薦經鼻吸入暴露5次，每次使用W0545約20 mg，每日合計使用約100 mg；每次吸入暴露時間約為1 min，每日合計暴露時間約為5 min。成人平均體重以60 kg計算，成人每日用以吸入暴露劑量為1.67 mg/kg（以W0545量計），大鼠等效吸入暴露劑量為10.35 mg/kg（以W0545 量計）。高、中、低劑量組：（1）吸入暴露劑量為103.5 mg/kg（以W0545量計），為人用劑量的62倍、大鼠等效吸入暴露劑量的10倍；（2）大鼠吸入暴露低、中、高劑量組的吸入暴露時間分別設為5 min、15 min、50 min，分別為人吸入暴露時間的1倍、3倍、10倍；（3）對照組動物放置在小動物單濃度口鼻暴露系統中吸入暴露環境空氣50 min。

圖1 小動物單濃度口鼻暴露系統工作原理圖Fig.1 Working principle of single concentration oral and nasal exposure system for small animals

1.2.3 吸入裝置工作原理及暴露方法：小動物單濃度口鼻暴露系統（HRH-MNE3026型組合式單濃度動等線物口鼻吸入暴露系統）主要包括發生系統、稀釋系統、采樣系統、監控系統、測量系統等部分。其工作原理圖1如下所示。潔凈的壓縮空氣經過質量流量控制器（MFC1）產生穩定流量的空氣進入collison型氣溶膠發生器，collison型氣溶膠發生器內放置秀爽逸散氣體發生瓶，瓶內裝有一次染毒所需秀爽，通過一定流速的氣體將秀爽揮發性成分帶出用于染毒給藥的氣溶膠。該氣溶膠進入上方的稀釋器，經過由質量流量控制器（MFC2）控制的稀釋空氣稀釋，產生穩定濃度的氣溶膠，以滿足總給藥氣體體積為500 mL/只/分鐘的給藥。進入高劑量組的氣溶膠輸送管供高劑量組的動物口鼻暴露吸入。未被動物吸入的氣體被系統以一定流量的速度抽走，同時暴露氣流持續產生，保證本實驗的一個動態的染毒系統。通過監測系統對整個吸入暴露實驗過程中溫度、濕度、染毒腔壓差、屏蔽柜壓差、氧氣濃度、二氧化碳濃度實時監測。

將大鼠按組別放置在小動物單濃度口鼻暴露系統的裝置中，經口鼻吸入W0545揮發氣體，每天吸入1次，連續吸入14天[3]，停止吸入恢復4周。首次吸入當天定義為暴露期第1天，末次吸入后1天定義為恢復期第1天。給藥過程中，小動物單濃度口鼻暴露系統的環境參數要求：平均氧氣濃度不低于20.63%，平均二氧化碳濃度不高于0.19%，平均溫度21.5～23.8℃，平均相對濕度26.8～40.0%，平均暴露腔內壓差-228.15～0.96pa。

1.2.4 動物觀察及檢測檢查：暴露期及恢復期每天觀察各組大鼠一般狀況；暴露期每周測定2次體重及攝食量，恢復期每周測定1次。觀察動物各組所有存活大鼠，包括但不限于大鼠存活率，攝食與飲水量，口鼻、外觀體征，被毛，一般行為活動，精神狀態，腺體分泌，皮膚和粘膜顏色，呼吸狀態，糞便性狀，生殖器等情況及其它非常態癥狀。檢測檢查指標包括眼科檢查、血液學檢查、血液生化檢查、尿液檢查、骨髓涂片、大體解剖觀察和組織病理學檢查。

1.3 統計學方法

所有數據由SPSS22.0 進行分析，體重、攝食量等定量指標采用均數±標準差（± SD）描述。采用Dunnett’s t檢驗（Dunnett法）對組間差異進行比較；P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 一般狀況

給藥期及恢復期，各組大鼠一般狀況良好、自主活動正常、皮膚被毛清潔，亦未見其它毒性反應。

2.2 體重

給藥期間及恢復期間，經口鼻吸入秀爽后，各組雌、雄鼠體重與對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2與圖3。

圖2 經口鼻吸入暴露秀爽對雄性SD大鼠體重的影響Fig.2 Effects of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on body weight of female SD rats

圖3 經口鼻吸入暴露秀爽對雌性SD大鼠體重的影響Fig.3 Effects of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on body weight of female SD rats

圖4 經口鼻吸入暴露秀爽對雄性SD大鼠攝食量的影響Fig.4 Effect of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on food ration of male SD rats

圖5 經口鼻吸入暴露秀爽對雌性SD大鼠攝食量的影響Fig.5 Effect of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on food ration of female SD rats

2.3 攝食量

給藥期第11～12天，高劑量組雌鼠攝食量與對照組相比升高，差異有統計學意義（P≤0.05），無毒理學意義。

除此之外，給藥期間及恢復期間，經口鼻吸入秀爽后，各組雌、雄鼠攝食量與對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4與圖5。

2.4 眼科檢查

暴露結束及恢復期結束，對照組和高劑量組大鼠雙眼屈光介質、視盤清晰，視網膜動脈管徑粗細均勻，靜脈無明顯擴張，亦未見視網膜、視盤以及角膜、虹膜、晶狀體、前房、后房等其它異常改變。

2.5 血液學

給藥結束及恢復期結束，各給藥組大鼠白細胞（WBC）及各分類計數及百分比、紅細胞計數（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細胞容積（HCT）、平均紅細胞容積（MCV）、平均紅細胞容積（MVC）、平均紅細胞血紅蛋白（MCH）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板計數（PLT）、網織紅細胞（RET）、網織紅細胞百分比（RET%）、活化部分凝血酶時間（APTT）、凝血酶原時間PT等血液生化指標均未見明顯差異改變（見表1）。

2.6 血液生化

給藥結束及恢復期結束，各給藥組大鼠天門冬氨基酸基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基酸轉移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、肌酸磷酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、尿素（Urea）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、白球比（A/G）、血糖（GLU）、總膽紅素（TBIL）、總膽固醇（CHOL）、甘油三酯TG、Na+、K+、Cl-、Ca、P、胰淀粉酶（AMY-P）、脂肪酶（LIPC）等血液生化指標均未見明顯差異變化（見表2）。

表1 經口鼻吸入暴露秀爽對SD大鼠血液學指標的影響Tab.1 Effect of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on hematological parameters in SD rats

續表1

表2 經口鼻吸入暴露秀爽對雄性SD大鼠血液生化指標的影響Tab.2 Effect of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on blood biochemical indicators in male SD rats

續表2

續表2

2.7 尿液檢查

給藥結束及恢復期結束，各給藥組雌、雄鼠尿液顏色、清澈度、葡萄糖、膽紅素、酮體、潛血、酸堿值、蛋白、尿膽原、亞硝酸鹽、白細胞、比重均未見明顯異常改變（見表3）。

表3 經口鼻吸入暴露秀爽對SD大鼠尿液檢查指標的影響Tab.3 Effect of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on urine examination indicators in SD rats

續表3

2.8 臟器重量及系數

給藥結束及恢復期結束，各給藥組雌、雄鼠腦、心臟、肝臟、腎臟、腎上腺、胸腺、脾臟、睪丸、附睪、卵巢、子宮的臟器重量、臟體/臟腦系數未見明顯異常改變（見表4）。

表4 經口鼻吸入暴露秀爽對SD大鼠臟器系數的影響Tab.4 Effect of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuangon organ coefficient in SD rats %

續表4

2.9 大體解剖觀察

暴露結束及恢復期結束，各給藥組所解剖大鼠大體肉眼觀察腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腎上腺、胸腺、胃腸道、生殖臟器等主要臟器，其大小、形態、顏色或質地均未見異常改變。

圖6 對照組大鼠重要臟器組織病理學檢查結果Fig.6 Histopathological examination of important organs in rats of control group

2.10 組織病理學檢查

暴露結束及恢復期結束，對照組和高劑量組大鼠腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腎上腺、胸腺、胃腸道、生殖臟器等主要臟器或組織均未見與供試樣品相關的異常組織病理學改變，見圖6、圖7。

圖7 暴露結束高劑量組大鼠重要臟器組織病理學檢查結果Fig.7 Histopathological examination of important organs in rats of high dose group

3 分析與討論

隨著各國反吸煙運動的日益增強，降低傳統煙草制品對消費者健康風險，開發新型煙草制品成為煙草行業追逐的熱點[4]。2011年，美國FDA授權IOM制訂了“MRTP研究的科學標準”[5]，為新型煙草制品的健康風險評估提供了一個指導性框架。根據該框架，MRTP健康風險評估主要包括煙草制品成分的化學分析、臨床前毒理學研究、臨床研究和長期隨訪研究。臨床前毒理學研究是評估程序中一個重要組成部分，通過毒理學評價的新型煙草制品方可進入臨床評估階段，以確保進入臨床評估階段的產品對人體風險較低，同時具有較高的“安全性”可能[6-13]。

按照產品的類型，無煙氣煙草制品分為美國濕含煙（Moist snuff）、瑞典含煙 Snus、含化型煙草制品（Dissolvable tobacco products，DTPs）、膠基型煙草制品、嚼煙、干含煙（Dry snuff）、西歐鼻煙、亞洲鼻煙等多種產品形式[14]，鼻煙主要通過鼻粘膜吸收其中的香味物質和/或生理強度物質，嚼煙和口含煙主要通過口腔黏膜吸收其中香味物質和生理強度物質。目前對無煙氣煙草制品安全性評價主要集中在有害化學成分分析，秦亞瓊等人[15]對國內外近30年關于無煙氣煙草制品化學成分分析的文獻進行了全面概述。①大部分文獻聚焦在無煙氣煙草制品中水分、pH、煙堿總含量、游離態煙堿含量、TSNAs的分析測定方面；對其他常規化學成分、添加劑、有害成分（除TSNAs）關注較少，但近年來呈逐漸增加趨勢。②在含量水平上，不同品牌、類型產品的常規化學成分及指標、添加劑、有害成分含量存在明顯差異。③在分析方法上，常規化學成分及添加劑的分析方法以GC和GC-MS為主；對于有害成分，大多采用GC-MS/MS或LC-MS/MS 進行檢測；目前對體內毒理學研究較少。

本文使用的寬窄?益德成秀爽（正紅）為一種新型封閉場所醒腦提神的無煙氣煙草制品，基礎原料來自非物質文化遺產傳承單位天津益德成的鼻煙粉“人參益氣散”。主要成分包括人參、石菖蒲、白寇、白芷、薄荷等，人參大補元氣，補脾安神為君藥；菖蒲開竅豁痰，醒神益智為臣藥；白芷、白寇上行頭目而清竅，兼能燥濕升陽，為佐藥，薄荷清涼走竄為史藥。寬窄益德成秀爽（正紅）采用玻態干燥技術制備秀爽專用鎖香和釋香顆粒，解決鼻煙粉香味容易散失和加工過程中流動性差的問題，通過MCT溶劑萃取法提取天然香料制備爆珠，借助三元復合空腔濾棒模擬鼻煙壺盛裝鼻煙粉（結構見圖8）。消費者通過一嗅、二捏、三分、四擠、五吸的方式消費秀爽；可鼻吸，達到醒腦提神、緩解焦慮疲勞；可口腔空吸，達到清新口氣的作用。

圖8 秀爽煙支結構示意圖Fig.8 Structural sketch of Xiushuang cigarette

管瑩等[6]采用染毒24 h后MTT、細胞凋亡觀察電子煙煙液進行細胞毒性實驗。劉炘等[16]采用大鼠30 d喂養相當于人體推薦攝入量100倍觀察沸玉菁茶安全性。通過與國家成都新藥安全性評價中心專家溝通，結合食品毒理學實驗教材指導建議：“在新藥安全性評價中，試驗期限等于或小于14 d”，加之研究經費原因，本研究參照新藥安全性評價方式，依從CFDA的GLP規范，對寬窄益德成秀爽進行為期14 d的大鼠口鼻暴露吸入毒理學評價。根據消費者每日推薦使用量換算大鼠暴露計量，最大暴露量為成人62倍，暴露時間為成人10倍。研究發現SD大鼠連續14 d、每天連續5 min、15 min、50 min以口鼻暴露方式吸入103.5 mg/kg劑量的寬窄益德成秀爽（正紅），暴露結束后恢復4 w，各組大鼠一般狀況、體重、攝食量、眼科檢查、血液學及血液生化檢查、尿液檢查、臟器重量及系數、大體解剖觀察及組織病理學檢查均未見明顯異常。由此推測在本研究劑量范圍內，寬窄益德成秀爽是安全的無煙氣煙草制品。

煙草行業普遍采用30 d或90 d的亞慢性毒性實驗進行口鼻暴露的卷煙煙氣毒理學研究。臨床藥物進入申報流程一般需要提供4 w毒性實驗結果，但在用藥劑量選擇中普遍采用7 d或14 d的毒性實驗。本研究因經費有限，結合臨床藥物劑量選擇最低要求，觀察大鼠14 d口鼻暴露寬窄益德成秀爽的實驗研究。因染毒周期較短，研究結論存在一定的偏差，以期在后續研究中延長染毒周期，結合免疫組織化學、PCR等技術觀察寬窄益德成秀爽使用安全性。

此外，本研究中爆珠香味成分為MCT溶劑萃取法提取秀爽中揮發性有效成分，本研究只對秀爽顆粒成分進行吸入安全性評價，未對整個秀爽煙支結構及爆珠進行捏碎后的吸入安全性評價。后續研究中會針對這個煙支結構及爆珠進行相關安全性評價。

4 結論

采用HRH-MNE3026型組合式單濃度動物口鼻吸入暴露系統建立大鼠口鼻暴露吸入毒理學評價實驗方案。經過14 d連續暴露寬窄益德成秀爽（正紅），與空白對照組相比，各受試組大鼠日常狀態、生理代謝指標、血液理化指標、組織病理學檢查等無明顯異常，為秀爽系列產品的使用安全性提供了依據。