非小細胞肺癌患者癌組織中HMGB1、MMP-9和FOXP3表達水平及臨床意義

金超超 金 諾 梅 芬 趙梅鳳

目前，臨床上對于非小細胞肺癌(NSCLC)的首選治療手段為手術切除，術后輔助放化療為其治療原則，但隨著NSCLC患者的逐漸增多，有研究顯示，予以相同方案進行治療的不同NSCLC患者其治療效果和預后情況也可存在一定的差異，故除去治療方案外，探討影響NSCLC患者預后的相關因素是目前臨床上一個值得重視的問題[1]。隨著研究的不斷深入，有資料顯示，在不同治療效果和預后的NSCLC患者間其相關蛋白及細胞因子等均存在著一定的差異[2]，故有學者認為相關蛋白和細胞因子的表達可能與NSCLC患者的預后有著密切聯系，但具體指標尚未闡述清楚[3]。本文通過回顧性分析100例NSCLC患者的臨床及隨訪資料，旨在探討NSCLC患者癌組織中高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)和叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子(FOXP3)表達水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年至2012年我院收治的100例NSCLC患者作為研究對象，其中男性76例，女性24例，年齡為36～80歲，平均年齡為(62.02±9.52)歲。納入標準：①所有患者均符合2004年世界衛生組織(WHO)中肺癌明確診斷標準[4]；②所有患者均在完善術前準備后行手術治療且術后均經病理學檢查確診為NSCLC；③本研究經醫院倫理委員會批準；④所有患者均知情同意本研究并簽署知情同意書。排除標準：①存在嚴重原發性肝腎功能不全者；②除去NSCLC外存在其他肺部疾病者；③存在其他惡性腫瘤者；④臨床及隨訪資料不完整者。

1.2 研究方法

選取100例NSCLC并行手術治療患者，并于術中收集其切取的NSCLC癌變組織100份作為研究組，另在手術過程中收集100份癌旁正常組織作為對照組，2組組織標本均采用免疫組織化學方法進行HMGB1、MMP-9和FOXP3水平的檢測。所有患者出院后均進行5年時間的隨訪，隨訪率為100%。

免疫組化所需試劑：HMGBl抗體購Ih abcam公司(79823)，MMP-9抗體，濃縮的人類FOXP3型鼠抗單克隆抗體原液，氯仿、無水乙醇、異丙醇均為國產分析純級試劑，DEPC水購自碧云天，即用型ChemMate EnVision兔/鼠通用型免疫組化試劑盒、3%H2O2離子水、DAB顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)、乙二胺四乙酸(Tris．EDTA)、丙氨基三乙氧基硅烷(APES)、丙酮(AR)、無水乙醇(AR)、95%乙醇(AR)、二甲苯(AR)、蘇木精體細胞快速顏色液、pH試紙、鹽酸(AR)和氨水(AR)。檢測方法：HMGB1、MMP-9和FOXP3均采用免疫組織化學染色(PV-9000 二步法)，一抗分別為HMGBl(1∶100)、 MMP-9(即用型)和Foxp3(1∶40)，用PBS替代一抗做陰性對照，試劑商提供的陽性片做陽性對照。

1.3 觀察指標及標準

根據其資料及檢測結果記錄所有患者的性別、年齡等一般臨床資料及腫瘤情況、HMGB1、MMP-9和FOXP3的水平及預后，并比較不同預后患者間HMGB1、MMP-9和FOXP3水平等相關資料的差異性。HMGB1、MMP-9和FOXP3陽性判定標準：HMGB1和FOXP3[5]：采用IHS=A×B來表示，其中A為陽性細胞數分級，陽性細胞數在0～1%之間為0，陽性細胞數在>1%～25%之間為1，陽性細胞數在>25%～50%之間為2，陽性細胞數在>50%～75%之間為3，陽性細胞數在>75%～100%之間為4；B為陽性細胞顯色強度，無著色=0，淡黃色=1，棕黃色=2，棕褐色=3，IHS≥3分為陽性表達，其中0～2 分為(-)，3～4 分為(+)，6～8 分為(++)，9～12 分為(+++)。MMP-9[6]：表達于細胞質，陽性染色呈棕黃色顆粒，且在顯微鏡下觀察細胞內應清晰可見、定位準確，而背景不著色。在高倍鏡下取4個不同的視野，并數200個癌細胞，根據MMP-9 陽性細胞所占的百分率判定 MMP-9 表達強弱。陰性(-)：無陽性細胞或陽性細胞數比例小于10%；弱陽性(+)：陽性細胞數比例為 10%～25%；中度陽性(++)：陽性細胞數比例為 25%～50%；強陽性(+++)：陽性細胞數比例>50%。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 2組組織標本中HMGB1、MMP-9和FOXP3表達水平比較

NSCLC患者其癌變組織中HMGB1、MMP-9和FOXP3的陽性表達率均顯著高于癌旁正常組織，比較差異均具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 2組組織標本中HMGB1、MMP-9和FOXP3表達水平比較/例

2.2 預后生存情況

研究100例NSCLC患者中，自出院后至隨訪結束存活1～50個月，中位生存時間為42個月，出院后1年生存率為90.00%(90/100)，3年生存率為82.00%(82/100)，5年生存率為68.00%(68/100)。HMGB1陰性患者和陽性患者其5年總生存率分別為86.67%(26/30)和60.00%(42/70)，MMP-9陰性和陽性患者其5年總生存率分別為93.75%(15/16)和63.10%(53/84)，而FOXP3陰性和陽性患者其5年總生存率分別為85.00%(34/40)和56.67%(34/60)，比較差異間均具有統計學意義(χ2=6.863，P=0.009；χ2=5.804，P=0.016；χ2=8.854，P=0.003)。

2.3 影響預后的單因素分析

經非條件單因素Cox 比例風險回歸模型顯示，吸煙、腫瘤低分化、出現淋巴結轉移以及HMGB1、MMP-9、FOXP3陽性表達和臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期的NSCLC患者其5年生存率均顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.4 影響預后的多因素分析

經多因素Cox比例風險回歸模型分析顯示腫瘤低分化、臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期、出現淋巴結轉移及HMGB1、MMP-9、FOXP3陽性均為影響NSCLC患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

3 討論

本組研究結果顯示，在NSCLC患者當中，其癌變組織中的HMGB1、MMP-9和FOXP3表達水平均顯著高于癌旁正常組織，由此可見HMGB1、MMP-9和FOXP3與NSCLC疾病的發生和進展有著一定的聯系。本組研究結果還顯示，吸煙、腫瘤低分化、出現淋巴結轉移以及HMGB1、MMP-9、FOXP3陽性表達和臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期的NSCLC患者其5年生存率均顯著降低，由此則進一步表明HMGB1、MMP-9、FOXP3在機體中的表達與NSCLC患者疾病進展和預后有著密不可分的關系，但關于其具體機制尚未完全報道。結合以往生化學研究[7]可知，HMGB1被認為是一種與腫瘤疾病發生和進展有著密切相關的促癌基因，其可一定程度上促進腫瘤細胞的增殖生長，加強腫瘤細胞的遷徙和轉移能力。故本研究認為，隨著HMGB1表達水平的增加，其陽性率越高，則可增加腫瘤細胞的數量，從而進一步加速病情發展和提高轉移風險，從而導致患者出現腫瘤細胞轉移和病情惡化，進而縮短生存時間[8]。而MMP-9屬于基質金屬蛋白酶的一種，其對細胞外基質的所有成分具有一定的降解作用，從而可導致腫瘤細胞沿著缺失的基膜向周圍組織浸潤，促進癌細胞向周圍正常組織侵襲，進一步加重機體的損傷導致其功能出現不可逆的下降和減退直至壞死[9]。另一方面，還有資料顯示，MMP-9對相關毛細血管的內生具有一定的促進作用，從而造成新血管給腫瘤細胞進行血氧營養成分的供給而促進其生長[10]。FOXP3屬于FOX家族的一員，其可一定程度上調控CD4+和CD25+的表達，從而對T細胞的分化和活化等具有一定的調控作用，出現免疫應答被抑制等情況，從而導致腫瘤細胞逃離相關免疫作用而繼續生長[11]。由此可見，HMGB1、MMP-9和FOXP3與NSCLC的生長均有著密切聯系，隨著其表達水平的上升，腫瘤進展越快對機體損害越大從而導致生存時間越短。且本文也經多因素Cox 比例風險回歸模型分析進一步證實腫瘤低分化、臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期、出現淋巴結轉移及HMGB1、MMP-9、FOXP3陽性均為影響NSCLC患者預后的獨立危險因素。

表3 影響預后的多因素分析

綜上所述，HMGB1、MMP-9和FOXP3在NSCLC患者癌組織中均以較高水平表達，且其陽性表達聯合腫瘤低分化、臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期和出現淋巴結轉移均為影響NSCLC患者預后的獨立危險因素。