基于非均相反應的新型固定化酶的構建及催化合成植物甾醇酯的研究

劉鑫龍，王立暉，劉鵬，安娜，陳光輝，趙瑞，杭忠霞

（天津現代職業技術學院生物工程學院，天津300350）

植物甾醇，能夠抑制人體對膽固醇的吸收，降低心血管疾病的發病率，目前已經被添加到多種食物中[1]。然而植物甾醇的高熔點和難溶于水的特性導致其很難被人體吸收利用[2]。將植物甾醇轉化為脂肪酸酯，形成稠度與食用脂肪和油脂相似的半流質液體，進而與含脂肪的食物結合，可以有效提高甾醇的生物利用率[3]。以植物甾醇與α-亞麻酸為底物合成的亞麻酸甾醇酯，不僅可以促進植物甾醇消化吸收，其中含有的α-亞麻酸也具有降血脂，保護肝臟等特殊功能。生物酶法合成植物甾醇酯不僅反應條件溫和、能耗低、副產物少，而且無溶劑污染[4]。然而游離酶價格高、穩定性差、難與底物分離，導致生產成本很高。通過將酶固定化，可以增強游離酶的穩定性和重復使用性，提高生物酶在實際生產中的應用價值。Zheng 等[5]將CRL 脂肪酶固定在二氧化硅顆粒上以提高其穩定性，并用于合成植物甾醇酯。在最優條件下（150 μmol/mL植物甾醇、1 ∶1.5 醇酸摩爾比、55 ℃、24 h）植物甾醇轉化率為95.3%。固定化酶在重復使用7 次后，仍保留有78.6%的初始活性。但反應過程中需要持續高轉速攪拌，而且催化劑重復使用時需要離心操作實現分離，必然導致操作復雜和成本的增大。

Pickering 乳液是利用固體顆粒作為乳化劑構建的油包水（w/o）或水包油（o/w）狀的兩相體系，可以將酶分子包含在水相中實現酶的固定化。脂肪酶是一種界面反應酶[6]，在兩相界面處催化活性最高，當含酶Pickering 乳液中催化非均相反應時，脂肪酶會自發富集在油水兩相界面處，充分利用兩相中的底物進行反應，展現高效的催化性能。此外，Pickering 乳液催化劑使用完畢后僅需靜置片刻，即會沉入容器底部實現與反應體系的分離，回收再利用因而變得非常容易。Jiang課題組[7]將以介孔硅固定化脂肪酶為乳化劑構建Pickering 乳液催化劑，并用于催化植物甾醇酯合成。生物柴油最大產率為95.8 %（水含量0.65%、酸醇摩爾比2 ∶1、酶用量 150 mg、30 ℃）。乳液催化劑在重復使用15 次后，產率為 88.6%。Wei 課題組[8]采用 Pickering 乳液固定化絲酵母脂肪酶催化水解外消旋酯，在無攪拌的條件下其絕對酶活（4.5 U/mg）是游離酶（0.2 U/mg）的22.5 倍。該Pickering 乳液固定酶重復使用27 次后仍保留91.7%的初始催化能力。據我們所知，將Pickering 乳液固定化脂肪酶用于催化合成亞麻酸甾醇酯得研究還未有報道。

本項目基于異辛烷和脂肪酶水溶液的兩相狀態，以多壁碳納米管為乳化劑構建一種新型的Pickering乳液固定化酶，并用于催化合成亞麻酸甾醇酯，通過單因素試驗篩選最優反應條件，以期得到一種高效的生產工藝，為酶促合成植物甾醇酯的工業化生產提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）：中國科學院成都有機化學有限公司；皺褶假絲酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase，CRL，15 U/mg）：杭州創科生物科技有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）：百靈威科技有限公司；植物甾醇（植物甾醇73.96%，菜籽甾醇17%，豆甾醇5%，菜油甾醇1 %，甾醇總量95.19 %）：西安藍天生物工程有限公司；亞麻酸（80 %）：河南利諾生化有限責任公司。

1.2 儀器與設備

超聲波細胞粉粹機（BILON-250Y）：北京比朗實驗設備有限公司；氣相色譜儀（SP-1000）：北京北分瑞利（集團）色譜儀器中心；激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP5）：Leica Microsystems 有限公司；掃描電子顯微鏡（Nova NanoSEM 450）：Field Electron and Ion Company（FEI）；激光粒度分析儀（LS-909）：珠海歐美克儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Pickering 乳液催化劑的制備

將20 mg MWCNTs 置于盛有3 mL 異辛烷的耐壓瓶中，再加入1 mL 含CRL 脂肪酶（9 U）的磷酸緩沖液（pH 7.0、0.1 mol/L），用超聲波細胞粉碎機超聲5 min（超聲 1 s，停歇 2 s，超聲溫度 30 ℃，功率 18 W），即可獲得Pickering 乳液催化劑，命名為CRL@PE。

1.3.2 亞麻酸甾醇酯的合成與檢測

在盛有CRL@PE 的耐壓瓶中，加入植物甾醇30 μmol，將其置于55 ℃水浴鍋中加熱5 min 以促進甾醇溶解。向耐壓瓶中加入30 μmol 的α-亞麻酸，并置于一定溫度下的恒溫水浴鍋中反應240 min。取10 μL 樣品通過氣相色譜分析計算植物甾醇的轉化率（公式1）[5]。每個樣品檢測3 次。

式中：A 為甾醇峰面積和（β-谷甾醇+菜籽甾醇+菜油甾醇+豆甾醇）；B 為甾醇酯峰面積和；1.63 為甾醇酯平均分子量與甾醇平均分子量的比值。

氣相色譜條件：毛細管柱型號為安捷倫DB-5 HT（15.0 m×320 μm×0.10 μm）。氣體流速 3.5 mL/min。進樣器溫度320 ℃，氫火焰離子化檢測器溫度350 ℃。色譜柱起始溫度 210 ℃，2 min 后以 10 ℃/min 的速度升溫至320 ℃，并保持15 min。最后再以10 ℃/min 的速度升溫至350 ℃。

1.3.3 亞麻酸甾醇酯合成的單因素優化

為了提高CRL@PE 催化能力和植物甾醇轉化率，采用單因素試驗分析含水率（2.0%～7.0%）、酸醇摩爾比（1 ∶1～5 ∶1）、酶用量（3 U～18 U）、反應溫度（25 ℃～50 ℃）和反應時間（0～24 h）對亞麻酸甾醇酯合成反應的影響，并篩選最優反應條件。

1.3.4 CRL@PE 性能評價

在眾多酶法合成植物甾醇酯工藝中，以植物甾醇轉化率為評價指標，綜合考慮生產成本，比較最優反應條件下CRL@PE 與其他催化劑的性能差異。

1.3.5 CRL@PE 的穩定性測定

每一輪亞麻酸甾醇酯合成反應結束后，將耐壓瓶靜置，待體系分層后小心的去除CRL@PE 中95%的異辛烷，然后用等量的新的異辛烷多次洗滌剩余物質，直至植物甾醇或植物甾醇酯去除干凈（氣相色譜分析中無底物和產物信號存在）。加入新的異辛烷、植物甾醇和亞麻酸（與第一輪反應中用量相等），開始下一批次反應。反應結束后，用氣相色譜分析和計算植物甾醇轉化率。

2 結果與討論

2.1 CRL@PE的表征

圖1 為CRL@PE 乳液的形貌圖。

圖1 CRL@PE 乳液的形貌圖Fig.1 The morphology of CRL@PE emulsion

在光學顯微鏡的觀察下（4×10 倍），CRL@PE 乳液由眾多球狀液滴組成，液滴直徑約 50 μm～80 μm（圖1a）。為了更細致的觀察CRL@PE 的形貌，利用1.5%質量分數的瓊脂水溶液作為水相構建乳液，室溫靜置至乳液液滴凝固后，借助掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 觀察 CRL@PE 液滴形貌，見圖1b。從圖1b 中可以確定，每個CRL@PE 液滴表面均覆蓋一層由若干無序、相互交織的納米管構成的外殼。因為瓊脂的凝固膨脹導致液滴形狀為不規則球體。為了確定乳液類型和脂肪酶CRL 在乳液中的位置，將CRL 用異硫氰酸熒光素標記后溶于磷酸鹽緩沖液中作為水相，構建CRL@PE，并通過共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）觀察現象，見圖1c。在圖1c 中，被標記的脂肪酶CRL 發出綠光（激發波長495 nm～545 nm），呈現一個個標準的圓形。鑒于CRL 僅溶于水，且異辛烷未被標記（無熒光現象），可以判斷CRL@PE 是油包水（w/o）的類型。

2.2 亞麻酸甾醇酯合成條件的單因素優化

采用CRL@PE 催化植物甾醇和亞麻酸酯化反應合成亞麻酸甾醇酯，反應過程受到乳液含水率、酸醇摩爾比、CRL 用量、反應溫度和反應時間的影響。為了獲得最大的植物甾醇轉化率，本部分采用單因素法初步判定最優的反應條件。

2.2.1 含水率的優化

研究磷酸緩沖液用量（水相）對乳液制備和植物甾醇轉化率的影響，并用含水率表示（%v/wt.，mL/100 mg MWCNTs），結果如圖2 所示。

圖2 含水率對植物甾醇轉化率的影響Fig.2 Effect of the water fraction on conversion efficiency of phytosterols

隨著含水率從2.0%增加到4.0%，植物甾醇轉化率（24 h）也從63.0%增長到80.4%。然而，當含水率進一步增加至7.0 %時，植物甾醇轉化率卻下降到了62.0%。這是因為含水率較低時，大量納米管堆積在液滴表面，形成厚厚的外殼，阻礙底物與界面處的酶分子接觸，抑制酯化反應的發生。當含水率超過4.0%，水相過量而納米管數量不足，導致CRL@PE 液滴不穩定，聚并變大導致界面面積減小。同時過量自由水（未用于構建乳液液滴的部分）的存在促進了植物甾醇酯的分解。因此，選擇含水率4.0%作為后續試驗條件。

2.2.2 酸醇比的優化

植物甾醇和亞麻酸的酯化反應從化學平衡角度分析，最佳配比為1 ∶1，但增大亞麻酸用量，可以提高植物甾醇的轉化率，酸醇摩爾比對植物甾醇轉化率的影響如圖3 所示。

圖3 酸醇摩爾比對植物甾醇轉化率的影響Fig.3 Effect of the molar ratio of linolenic acid to phytosterol on conversion efficiency of phytosterols

隨著酸醇摩爾比的增加，植物甾醇轉化率也隨之增長，但增長趨勢在摩爾比為2 ∶1 時達到最大，此時植物甾醇轉化率達到最高值為85.9 %。綜合考慮成本因素，選擇酸醇摩爾比2 ∶1 作為后續反應的操作條件。

2.2.3 酶用量的優化

酶用量對植物甾醇轉化率的影響如圖4 所示。

圖4 酶用量對植物甾醇轉化率的影響Fig.4 Effect of the dosage of lipase on conversion efficiency of phytosterols

植物甾醇轉化率隨著酶用量的增加（3 U～18 U）迅速上升。而酶用量的持續增加（＞15 U），卻會導致轉化率降低。這可能歸結于兩個原因：1）在CRL@PE 中脂肪酶大量聚集在兩相界面，改變了界面處酶分子的微環境，導致催化性能受到影響；2）脂肪酶也可能堆積在水相核心，因接觸不到底物而難以發揮效力。綜上所述，選擇酶用量12 U 作為后續反應的催化劑用量。

2.2.4 反應溫度和反應時間的優化

溫度對植物甾醇轉化率的影響如圖5 所示。

圖5 反應溫度對植物甾醇轉化率的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on conversion efficiency of phytosterols

隨著溫度的增加，植物甾醇轉化率逐漸增加；在30 ℃時達到最大值93.2%（12 h）；此后繼續提高溫度，轉化率開始下降，而且溫度越高，轉化率下降越嚴重。這是因為低溫或較高的溫度會抑制酶的催化性能，導致反應速度降低；高溫會促使酶蛋白變性，脂肪酶因結構改變而失活。因此，選擇30 ℃作為后續試驗的反應溫度。因此，本試驗中采用30 ℃作為反應溫度。

隨著反應時間的推移，植物甾醇轉化率逐漸提高，達到最大值后基本保持不變，證明反應即將達到平衡點。考慮成本因素，選擇12 h 作為最佳反應時間，此時轉化率為93.2%。

2.2.5 CRL@PE 性能評價

表1 顯示了CRL@PE 與其他酶催化劑在合成植物甾醇酯反應中的性能差異。以植物甾醇轉化率高低為評價標準，綜合考慮能耗和生產成本，CRL@PE 法合成植物甾醇酯具有反應條件溫和、底物轉化效率高、催化劑性能優異的特點，是一種相對高效的亞麻酸甾醇酯生產工藝。

表1 CRL@PE 與其他酶催化劑合成植物甾醇酯性能的比較Table 1 Comparison of the performance of CRL@PE with other lipase catalysts in synthesis of phytosterol esters

2.3 CRL@PE的穩定性

重復使用性能是評價催化劑應用價值的一個重要參數。圖6 顯示了CRL@PE 在催化植物甾醇酯合成過程中的性能變化。

圖6 CRL@PE 的重復使用性Fig.6 The reusability of CRL@PE

CRL@PE 重復使用10 次后，植物甾醇轉化率為92.06%，保持不變。此時CRL@PE 液滴大小基本未受到重復使用的影響。使用15 次后，轉化率為77.3%。由此可見，CRL@PE 具有良好的重復使用性。

將CRL@PE 置于不同溫度下水浴鍋中恒溫加熱3 h 后，于最優條件下催化合成植物甾醇酯，分析CRL@PE 熱穩定性，結果如圖7 所示。

圖7 CRL@PE 的熱穩定性Fig.7 The thermal stability of CRL@PE

在30 ℃時轉化率最大為92.2%。而任何微小的溫度變化都會導致活性下降。長期接觸溫度高于30 ℃會損害CRL@PE 的結構，然后破壞和水平從而減少活動將隨著溫度增加而增加。低溫（＜30 ℃）會影響傳質速度，導致活動減少。

3 結論

本試驗以納米管為乳化劑，基于非均相反應構建了一種新型的Pickering 乳液催化劑CRL@PE，其具有油包水的結構，液滴直徑為40 μm～60 μm。同時本課題組于國內首次研究利用乳液催化劑合成亞麻酸甾醇酯的工藝過程，其最優反應條件為：含水率4.0%、酸醇摩爾比 2 ∶1（植物甾醇 30 μmol）、酶用量 12 U、溫度30 ℃、反應時間10 h，此時植物甾醇最大轉化率為92.13%。此外，CRL@PE 具有良好的重復使用性和熱穩定性，但對溫度變化較為敏感。

下一階段將詳細研究CRL@PE 的催化特性，包括催化動力學、失活動力學。采用更加科學嚴謹的方法研究CRL@PE 催化不同反應時的最佳條件。