女貞子提取物中齊墩果酸含量及抗腫瘤活性研究

王沛君，王森業(yè)，徐瑞芳，馮瑞，張磊，李曉楠，孫顏杰，2，*

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000）

女貞子為木犀科植物女貞（Ligustrum lucidum Ait）的干燥成熟果實(shí)，在浙江、江蘇、河南等均有產(chǎn)，味甘、苦，性涼，歸肝、腎經(jīng)，常用于肝腎陰虛，眩暈耳鳴，腰膝酸軟，須發(fā)早白，目暗不明，內(nèi)熱消渴，骨蒸潮熱等[1]。有研究表明，齊墩果酸是女貞子中的重要活性成分之一，具有護(hù)肝腎[2]、抗病毒[3]、調(diào)血脂[4]、抗菌[5]、降血糖[6]、抗腫瘤[7]等多種藥理作用。近年來(lái)對(duì)女貞子中齊墩果酸的提取工藝甚多，常見(jiàn)的有回流提取法、超聲波輔助提取法、冷浸法等。如蔣珍菊[8]、莫穎華[9]、郗艷麗[10]對(duì)女貞子中齊墩果酸的提取進(jìn)行了一定的探索和優(yōu)化，但是較少文獻(xiàn)比較不同提取方法提取的效果。因此本試驗(yàn)采用乙醇回流法、超聲輔助提取法、索氏提取法、冷浸法4 種方法對(duì)女貞子中的齊墩果酸進(jìn)行提取，確定最佳工藝；文獻(xiàn)報(bào)道女貞子主要成分齊墩果酸具有抑制人乳腺癌、肺癌細(xì)胞（MCF27）增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用[11]，董靜[12]報(bào)道齊墩果酸對(duì)S180 荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡有明顯的影響，細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯增加，也指出女貞子中天然有效成分齊墩果酸可下調(diào)腫瘤細(xì)胞中的B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（Bcl-2）蛋白的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞色素C 與Caspase-3 的表達(dá)水平增高，從而達(dá)到抑制荷瘤小鼠腫瘤的增長(zhǎng)的作用。本試驗(yàn)在已有研究的基礎(chǔ)上以人結(jié)腸癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)女貞子提取物體外抗腫瘤活性做進(jìn)一步研究，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，探討誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響，推動(dòng)提取物的臨床應(yīng)用，為開(kāi)發(fā)女貞子提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

女貞子于2017年11月采自河南省新鄉(xiāng)市新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，將材料于50 ℃烘箱中干燥，保存于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院藥學(xué)院，備用。

1.1.2 儀器

N4 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司制造；BT125D 電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市華峰儀器有限公司制造；101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海科恒實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；CL-2 型恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SENCO 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；SHB-3 循環(huán)多用真空泵：鄭州杜甫儀器廠；CX22 倒置顯微鏡：奧林巴斯公司；CO2培養(yǎng)箱：英國(guó)Biotech 公司；ELISA 分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；KQ-500E 型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.1.3 試劑

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（C1723001）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司、噻唑藍(lán)（MTT）：Sigma 試劑公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、95%乙醇、無(wú)水甲醇、乙酸乙酯、冰乙酸、香草醛、高氯酸：天津市德恩化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液的制備

1.2.1.1 超聲輔助提取法

稱(chēng)定女貞子5.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入10 倍量的95%乙醇，超聲輔助提取30 min，過(guò)濾，重復(fù)3 次，合并3 次濾液，減壓濃縮干燥得提取物，甲醇定容于100 mL 容量瓶中，搖勻，即得。

1.2.1.2 索氏提取法

稱(chēng)定女貞子5.0 g，置于索氏提取器中，加入10 倍量的95%乙醇，在85 ℃下回流3 次，每次2 h，合并3次濾液，減壓濃縮干燥得提取物，甲醇定容于100 mL 容量瓶中，搖勻，即得。

1.2.1.3 回流提取法

稱(chēng)取女貞子5.0 g，置于250 mL 圓底燒瓶中加10倍量的95%乙醇回流提取，每次2 h，重復(fù)3 次，合并3 次濾液，減壓濃縮干燥得女貞子提取物，甲醇定容于100 mL 容量瓶中，搖勻，即得。

1.2.1.4 冷浸法

稱(chēng)定女貞子5.0 g，參考秦晶晶等[13]文獻(xiàn)制備，減壓濃縮干燥得提取物，甲醇定容于100 mL 容量瓶中，搖勻，即得。

1.2.2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照李西騰等[14]文獻(xiàn)，精密稱(chēng)取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，加甲醇定容于50 mL 容量瓶中，搖勻即得濃度為0.10 mg/mL 的對(duì)照品溶液。精密吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 置于試管中，80 ℃水浴蒸干甲醇，加0.2 mL 香草醛-冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸，在60 ℃水浴加熱15 min 后，移入冰水浴中，再加入4.0 mL 的乙酸乙酯，搖勻，在560 nm 處測(cè)定吸光度值。以齊墩果酸濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程，計(jì)算R2。

1.2.3 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取6 份對(duì)照品溶液0.3 mL，按1.2.2 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，計(jì)算平均值及RSD（%）值。

1.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取1.2.1.3 項(xiàng)下供試品溶液1.0 mL，甲醇定容于10 mL 容量瓶中，得供試品稀釋液。分別精密吸取 6 份上述稀釋液 0.5 mL，于 0、2、4、6、8、10 h 按 1.2.2方法測(cè)定吸光度值，計(jì)算平均值及RSD（%）值。

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取1.2.1.3 項(xiàng)下供試品溶液1.0 mL，甲醇定容于10 mL 容量瓶中，得供試品稀釋液，分別精密吸取6 份上述稀釋液0.5 mL，按1.2.2 方法測(cè)定吸光度值，計(jì)算平均值及RSD（%）值。

1.2.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取1.2.1.3 項(xiàng)下供試品溶液1.0 mL，甲醇定容于10 mL 容量瓶中，得供試品稀釋液，分別精密吸取6 份上述稀釋液0.2 mL，再加入對(duì)照品溶液0.2 mL，按1.2.2 項(xiàng)下方法操作，測(cè)定吸光度值，計(jì)算平均值及RSD（%）值。

1.2.7 樣品的含量測(cè)定

分別精密吸取1.2.1 項(xiàng)下供試品溶液1.0 mL，甲醇定容于10 mL 容量瓶中，得供試品稀釋液，分別精密吸取3 份上述稀釋液0.5 mL，按1.2.2 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，運(yùn)用回歸方程計(jì)算樣品含量。

1.3 女貞子提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖影響

1.3.1 MTT 的配制

MTT 在無(wú)菌條件下，用高壓過(guò)的磷酸緩沖鹽溶液（phosphste buffer saline，PBS）配成 2 mg/mL，0.22 μm 無(wú)機(jī)濾膜過(guò)濾除菌，4 ℃冰箱避光保存。

1.3.2 藥物稀釋

稱(chēng)取藥物，使用90 % DMSO 作為溶劑，配成14.000 mg/mL，并用 0.22 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾除菌，4 ℃保存。使用時(shí)按等比例稀釋依次用90%DMSO 配成相應(yīng)的濃度，使用后，藥物保存于4 ℃。

1.3.3 細(xì)胞處理

將細(xì)胞培養(yǎng)在含10%新鮮滅活胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2）。結(jié)合李康等[15]文獻(xiàn)，待HCT116 與HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)良好并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用0.25%的胰酶消化，收集并計(jì)數(shù)，均勻的鋪到 96 孔板中（約 7×103個(gè)/孔），在二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞完全貼壁并且呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，加入各濃度梯度的藥物，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組（90%DMSO），每個(gè)藥物濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。在相同條件的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。在二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中孵育48 h 后，每孔加入 10 μLMTT（2 mg/mL），在二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h 后，終止培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)孔中的液體。每孔加入100 μL DMSO 溶液，并設(shè)置空白對(duì)照組。置于低速搖床上振蕩10 min，以溶解殘留的MTT-甲臜結(jié)晶，于多功能酶標(biāo)儀上495 nm 處測(cè)定各孔的吸光度。以吸收抑制百分比為生長(zhǎng)抑制率，試驗(yàn)重復(fù)3 次，按照公式：生長(zhǎng)抑制率/%=1-[（試驗(yàn)組OD值-空白孔OD 值）/（陽(yáng)性對(duì)照組OD 值-空白對(duì)照組OD 值）]×100，計(jì)算女貞子提取物對(duì)兩種癌細(xì)胞增殖的抑制效果，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品步驟同上，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)繪圖采用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行，數(shù)值表示為平均值D，半數(shù)抑制濃度采用SPSS.22 進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

以齊墩果酸濃度x（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，通過(guò)線性擬合得回歸方程為y=0.008 8x-0.065 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5 大于0.99，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。表明齊墩果酸濃度在 20 μg/mL～120 μg/mL 范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

圖1 齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of oleanolic acid

2.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1 可知，測(cè)得6 份齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的平均吸光度值為0.171，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值（relative standeard deviation，RSD）為0.52%，表明本試驗(yàn)的精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 1 The results of precision experiment（n=6）

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 2 The result of stability experiment（n=6）

由表2 可知，測(cè)得 0、2、4、6、8、10 h 供試品溶液的平均吸光度值為0.512，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值RSD 為0.17%，表明本試驗(yàn)的穩(wěn)定性良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3 可知，測(cè)得6 份供試品溶液的平均吸光度值為0.171，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值RSD 為0.52%，表明本試驗(yàn)的重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 The results of repeatability experiment（n=6）

2.5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

加樣回收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 4 The results of sample addition experiment（n=6）

由表4 可知，測(cè)得6 份供試品溶液的平均加樣回收率為100.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為0.76%，表明本試驗(yàn)的加樣回收率良好。

2.6 不同提取方法中的齊墩果酸含量的結(jié)果

按照“1.2.2”項(xiàng)下方法對(duì)“1.2.1”項(xiàng)下供試品溶液進(jìn)行齊墩果酸含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同提取方法中的齊墩果酸含量Table 5 Contents of oleanolic acid in different extraction methods

由表5 可知，4 種不同提取方法中的齊墩果酸含量由高到低依次為回流提取法（13.13±0.03）mg/g、索式提取法（12.19±0.03）mg/g、超聲輔助提取法（11.56±0.02）mg/g、冷浸法（11.16±0.02）mg/g。

2.7 女貞子提取物對(duì)人結(jié)腸癌、人肝癌細(xì)胞增殖的影響

2.7.1 女貞子提取物及齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品干預(yù)HCT116細(xì)胞48 h 后的細(xì)胞形態(tài)

女貞子提取物及齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品干預(yù)HCT116 細(xì)胞48 h 后的細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖2。

圖2 各組干預(yù)HCT116 細(xì)胞48 h 后的細(xì)胞形態(tài)（×200）Fig.2 Cell morphology of HCT116 cells after 48 h intervention in each group（×200）

如圖2 所示，女貞子提取物與齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品作用于HCT116 細(xì)胞48 h 后，細(xì)胞形態(tài)皺縮，有變圓趨勢(shì)，且部分細(xì)胞有漂浮現(xiàn)象。隨著其濃度的增大，細(xì)胞形態(tài)受損程度也逐漸增強(qiáng)。由F 與J 兩個(gè)圖片對(duì)比可知，同濃度下的女貞子提取物與齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品作用于HCT116 細(xì)胞，女貞子提取物使細(xì)胞皺縮與受損的程度強(qiáng)于齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品。

2.7.2 女貞子提取物及齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品干預(yù)HEPG2細(xì)胞48 h 后的細(xì)胞形態(tài)

女貞子提取物及齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品干預(yù)HEPG2 細(xì)胞48 h 后的細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖3。

圖3 各組干預(yù)HEPG2 細(xì)胞48 h 后的細(xì)胞形態(tài)（×200）Fig.3 Cell morphology of HEPG2 cells after 48 h intervention in each group（×200）

如圖3 所示，女貞子提取物與齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品作用于HEPG2 細(xì)胞48 h 后，細(xì)胞形態(tài)皺縮，有變圓趨勢(shì)，且部分細(xì)胞有漂浮現(xiàn)象。隨著其濃度的增大，細(xì)胞形態(tài)受損程度也逐漸增強(qiáng)。由P 與R 兩個(gè)圖片對(duì)比可知，同濃度下的女貞子提取物與齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品作用于HEPG2 細(xì)胞，女貞子提取物使細(xì)胞皺縮與受損的程度強(qiáng)于齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品。

2.7.3 女貞子提取物及其齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增值的影響

女貞子提取物及其齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增值的影響見(jiàn)圖4。

如圖4 所示，不同濃度的女貞子提取物與齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞48 h 后，經(jīng)過(guò)MTT 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)女貞子提取物濃度為0.05 μg/mL 時(shí)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制率為0.57%，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.05 μg/mL 時(shí)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制率為0.10%，當(dāng)兩者的濃度增加到35.00 μg/mL 時(shí)，對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制率分別為88.58%、86.93%，由此可見(jiàn)女貞子提取物與齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)出一定的濃度相關(guān)性，且女貞子提取物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品。

圖4 女貞子提取物及其齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增值的影響Fig.4 Effect of Fructus Ligustri Lucidi and the standard oleanolic acid on the proliferation of human colon cancer cells

2.7.4 女貞子提取物及其齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)人肝癌細(xì)胞增值的影響

女貞子提取物及其齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)人肝癌細(xì)胞增值的影響見(jiàn)圖5。

圖5 女貞子提取物及齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)人肝癌細(xì)胞增值的影響Fig.5 Extract of Fructus Ligustri Lucidi and the standard oleanolic acid on the proliferation of liver cancer cells

如圖5 所示，不同濃度的女貞子提取物與齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品作用于人肝癌細(xì)胞48 h 后，經(jīng)過(guò)MTT 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)女貞子提取物濃度為0.05 μg/mL 時(shí)對(duì)人肝癌細(xì)胞的抑制率為7.31%，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.05 μg/mL 時(shí)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制率為4.96%，當(dāng)兩者的濃度增加到35.00 μg/mL 時(shí)，對(duì)人肝癌細(xì)胞的抑制率分別為84.47%、78.00%，由此可見(jiàn)女貞子提取物與齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)人肝癌細(xì)胞的抑制作用也呈現(xiàn)出一定的濃度相關(guān)性，且女貞子提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品。

由以上數(shù)據(jù)計(jì)算得女貞子提取物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞 48 h 后的 IC50值分別為 22.08、13.47 μg/mL，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞 48 h 后的 IC50值分別為 41.45、45.90 μg/mL。

3 結(jié)論

通過(guò)試驗(yàn)比較得出齊墩果酸的含量由高到低依次為回流提取法、索氏提取法、超聲輔助提取法、冷浸法，與秦晶晶等[16]結(jié)果一致。超聲輔助提取法，耗時(shí)短，易控制反應(yīng)條件，但提取含量較低；冷浸法，操作簡(jiǎn)單，但耗時(shí)長(zhǎng)，耗材大，提取含量最低；索氏提取法僅次于乙醇回流，但由于裝置的特點(diǎn)，盛裝藥材有限，因此不作為首選工藝；乙醇回流法，操作簡(jiǎn)單，提取效率最高，因此首選乙醇回流提取法。

近年來(lái)，中藥及其提取物在抗腫瘤的治療研究中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[17]，如高飛等[18]發(fā)現(xiàn)竹葉提取物具有潛在的抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)的雙重功效，譚輝等[19]發(fā)現(xiàn)紫山藥花青素有一定的抗腫瘤效應(yīng)。因此，改進(jìn)和完善女貞子有效活性成分的提取工藝，深入研究其抗腫瘤成分及作用機(jī)制，對(duì)天然藥物在抗腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用有積極意義。

在體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)比較女貞子提取物和齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)兩種癌細(xì)胞的IC50值，發(fā)現(xiàn)女貞子提取物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的IC50值（22.08 μg/mL）小于齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)其的 IC50值（41.45 μg/mL），對(duì)人肝癌細(xì)胞的IC50值（13.47 μg/mL）小于齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)其的 IC50值（45.90 μg/mL），表明女貞子提取物對(duì)兩種癌細(xì)胞的增殖均有顯著的抑制作用，同時(shí)可以得出該提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞的選擇性?xún)?yōu)于結(jié)腸癌細(xì)胞，該差異考慮可能是關(guān)系到該提取物對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞的抑制機(jī)理不同，為以后抗腫瘤機(jī)制分析提供參考。這也是首次發(fā)現(xiàn)女貞子提取物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116有抑制作用，為充分開(kāi)發(fā)利用女貞子提供了科學(xué)的參考依據(jù)。