桑黃子實體多糖超聲波微波協同輔助提取及活性研究

應瑞峰，黃梅桂，王耀松，吳彩娥，李婷婷，范龔健

（南京林業大學輕工與食品學院，江蘇南京210037）

桑黃主要寄生在桑樹上，它是一種真菌，有些地方也叫作桑臣、桑耳或鮑氏層孔菌，并且有著黃褐色的子實體，因而得名。桑黃在分類上屬于擔子菌門、銹荸孔菌科、針層孔菌屬。在我國桑黃主要寄生于楊樹、松樹、柳樹、杜鵑等樹的樹干上，桑黃分布比較廣泛，主要集中分布在我國東北、西北、華北等地，尤其在原始森林中。桑黃早在2000 多年前，記載桑黃用作昂貴的中藥，其最大的特點就是：桑黃具有非常突出的調節機體免疫，延緩衰老和抗腫瘤的效果[1-2]。桑黃子實體具有很好的抗腫瘤效果，很多研究結果表明，桑黃提取物能有效抑制腫瘤的生長和繁殖，是目前國際上各國公認的生物抗癌領域中效率最高的真菌，因此桑黃成為國內外醫藥界研究的熱點。桑黃的主要化學成分有很多，主要是：萜類、黃酮類和多糖等。許多研究表明多糖是桑黃最重要的生物活性成分，它在抑制腫瘤細胞方面作用尤其顯著，它不但存在于桑黃子實體，也存在于桑黃的菌絲體中和桑黃的發酵液中[3-4]。隨著產業的升級進步，超聲波微波輔助提取技術被應用于真菌或植物活性物質的提取，特別是一些富有前瞻性的產業化工廠也將其應用于真菌多糖的提取，但得率仍然比較低，有一些研究也應用微波輔助技術，技術有著反應條件溫和、周期短、成本低等優勢，也有報道此技術運用到真菌多糖的提取中[5-6]，將超聲波微波技術運用到桑黃多糖提取的研究卻是非常少的。本次研究中應用超聲波協同微波法對桑黃進行多糖的提取，尋找最佳提取條件，最大限度的提高桑黃多糖得率，并且為桑黃產業化提供可行的理論基礎。本研究應用復合超聲波微波法對桑黃子實體多糖進行提取，然后對提取得到的多糖進行活性研究，其研究結果能為桑黃開發和綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑黃子實體：浙江省淳安千島湖桑都食用菌合作社；超純水：南京林業大學食品實驗室自制；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxido，DMSO）：Sigma 公司；乙醇（純度 95%）：南京化學試劑公司；96 孔細胞培養板：Costar 公司；RPMI 1640 培養基、DMEM培養基、胎牛血清：Gibco 公司；EnoGeneCellTMCounting Kit-8（CCK-8）細胞活力檢測試劑盒：南京恩晶生物科技有限公司；紫杉醇：中國四川太極制藥公司。

1.2 儀器與設備

XO-SM200 超聲波微波輔助提取設備：中國南京先歐儀器制造有限公司；QT-58A 紫外檢測儀：中國上海琪特儀器公司；TU-1800PC 紫外可見分光光度計：中國北京普析通用公司；SW-CJ-1FD 超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術公司；MCO-15AC 二氧化碳培養箱：日本三洋SANYO；XD-202 熒光倒置生物顯微鏡：中國南京江南永新公司；Thermo MK3 酶標儀：美國熱電有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 桑黃多糖提取工藝流程

桑黃子實體→粉碎→超聲波微波復合提取→過濾→80%醇沉→離心→沉淀復溶→醇沉→干燥→粗多糖

1.3.2 桑黃多糖提取工藝單因素試驗

1）提取時間的選擇：稱取5 份2.0 g 的桑黃菌干粉，每份樣品分別注入100 mL 的蒸餾水，液料比為50 mL/g，設定超聲波功率為360 kW，微波功率為100 W，提取溫度為100 ℃，在此條件下，提取時間設定為 20、30、40、50、60 min，然后測定樣品的多糖含量，并計算多糖的提取率。

2）提取液料比的選擇：精確的稱取5 份2.0 g 的桑黃菌干粉，設定超聲波的功率為360 kW，提取時間設定為40 min，提取溫度為100 ℃，5 份樣品的液料比分別以 20、30、40、50、60 mL/g，提取結束后，分別測定提取物的多糖的含量和多糖的提取率。

3）超聲波功率對桑黃多糖提取率的影響：分別稱取2.0 g 桑黃菌粉5 份，液料比為50 mL/g，按比例加入蒸餾水，超聲波功率設定為 60、180、360、720、900 kW，微波功率為100 W，提取溫度為100 ℃，處理時間設定為40 min，分別測定多糖的含量和多糖提取率。

4）微波功率對桑黃多糖提取率的影響：試驗中稱取5 份桑黃菌粉2.0 g，加入蒸餾水，溶液的液料比為50mL/g。設定超聲波功率為360kW，提取溫度為100℃，分別在微波功率 100、200、300、400、500 W 條件下，處理40 min，提取結束后測定樣品中多糖的含量和多糖的提取率。

1.3.3 桑黃多糖提取工藝正交試驗設計

試驗首先進行單因素試驗，然后在此基礎上，進一步采用三因素三水平的提取試驗見表1，按L9（34）的正交設計方案，設計并且實施多糖提取的正交試驗，每組試驗都要重復3 次以上。

表1 正交試驗因素水平表Table Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.4 總糖含量與蛋白質含量測定

本次試驗采用的是苯酚－硫酸法，選擇以葡萄糖為試驗的標準品，通過試驗測定樣本總糖含量；本試驗中，選擇以牛血清白蛋白為標準品，采用考馬斯亮藍法，測定樣品中蛋白質的總含量。

1.4 試驗條件

1.4.1 桑黃多糖體外抗氧化活性

1）清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH）能力測定：稱取樣品分別配制成 12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL 濃度的溶液。配制 0.1 mmol/L DPPH 溶液。準確移取各個待測液2.0 mL 于10 mL 透明試管中。使用移液管分別加入2.0 mL，0.1 mmol/LDPPH 溶液，用振蕩機混勻，放置一段時間，再用紫外分光光度計測定517 nm 波長處的吸光度，記為A樣品。做3 組平行試驗。準確移取各濃度待測液2.0 mL 與相應溶劑（水）2.0 mL，再用振蕩機混勻，放置一段時間，測定在517 nm 波長處的吸光度，記為A對照。準確移取DPPH溶液2.0 mL 與相應溶劑（無水乙醇）2.0 mL，振蕩機混勻，測定在517 nm 波長處的吸光度，記為A空白。為了分析試驗結果，VC作為陽性對照物，按以下公式計算DPPH 自由基清除率：

式中：I 為樣品對超氧負離子的清除率，%；A樣品為樣品測試值；A空白為空白值；A對照為對照值。

2）清除超氧負離子的測定：樣品被鹽酸三羥甲基氨基甲烷（Tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris-HCl）緩沖液（pH 值為 8.0，濃度為 16 mmol/L）溶解，制成不同濃度的溶液。氯化硝基四氮唑藍（nitrotetrazole chloride blue，NBT）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nionamide adenine dinucleotide，NADH） 均 用 Tris-HCl 緩 沖 液（pH8.0，16 mmol/L）溶解，濃度分別為 300、468 μmol/L；然后用蒸餾水溶解吩嗪硫酸甲酯（phenazine methyl sulfate，PMS），其濃度為 60 μmol/L。取 1.50 mL 不同濃度的樣品溶液，0.50 mL NBT，0.5 mL NADH，混勻，加入0.5 mL 的PMS，然后將桑黃樣品更換為1.50 mL 的緩沖溶液，作為試驗中的空白對照。然后按照相同的操作方法，在25 ℃的水浴中放置5min 后，測定樣品的吸光度（波長為560 nm），每次操作重復3 次以上。試驗結束后，計算超氧負離子清除率I，計算公式為：

式中：I 為試驗樣品對超氧負離子的清除率，%；A樣品為樣品的測試值；A空白為空白對照值。

1.4.2 桑黃多糖體外抗腫瘤活性

CCK-8 染色法檢測細胞活力：試驗中挑選活細胞比例90%以上的細胞，進行樣品測試。細胞增殖抑制試驗采用EnoGeneCelTMCounting Kit-8（CCK-8）細胞活力檢測試劑盒。制成濃度為1×105個/mL 的細胞懸液，試驗中，在96 孔板中，每一個孔中加入100 μL 細胞懸液；然后將96 孔板放置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養，培養時間為24 h；每一個孔，分別加入100 μL相應的含藥物的培養基。試驗中，要求同時設立陰性對照組，陽性對照組和溶媒對照組，每一個組要求5 復孔；96 孔板放置于培養箱中培養，溫度為37 ℃，CO2濃度為 5%，培養 72 h；每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，試驗中將培養板放置在培養箱內孵育，時間設定為4 h，用酶標儀測定在450 nm 處的OD 值，計算桑黃多糖對人肝癌細胞HepG2，人宮頸癌細胞Hela 細胞的抑制率及IC50值。

1.5 數據分析

利用SPSS 12.0 軟件進行數據分析（t 檢驗），分析組間差異。試驗數據用表示。

2 結果與分析

2.1 超聲波微波協同作用

液料比對桑黃子實體多糖得率的影響見圖1。

圖1 液料比對桑黃子實體多糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on the extraction yield of polysaccharides

由圖1 可知，桑黃多糖熱水提取過程中，隨著液料比增大，桑黃多糖得率顯著增高，較高的液料比加快了水的傳質過程，當液料比為50 mL/g 時，桑黃多糖得率最高，但高于50 mL/g 時，得率又會下降，因此，選擇液料50 mL/g 比較合適。

超聲功率對桑黃子實體多糖得率的影響見圖2。

如圖2 所示，隨著超聲波功率的加大，桑黃多糖得率大幅的增加，功率在360 kW 時多糖的得率達到最高值，之后多糖得率迅速下降，大功率超聲波對細胞壁和細胞膜的破壞作用較大，使桑黃多糖結構發生破壞或者使其降解。

微波功率對桑黃子實體多糖得率的影響見圖3。

如圖3 所示，微波功率在200 W 時，多糖的提取率最高，超過200 W，提取率開始下降。

圖2 超聲功率對桑黃子實體多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power onthe extraction yield of polysaccharides

圖3 微波功率對桑黃子實體多糖得率的影響Fig.3 Effect ofmicrowave power on the extraction yield of polysaccharides

提取時間對桑黃子實體多糖得率的影響見圖4。

圖4 提取時間對桑黃子實體多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasound treatment time on the extraction yield of polysaccharides

桑黃子實體提取過程中，由圖4 可知，多糖得率隨著提取時間增加而增大，30 min 內的增加趨勢明顯，30 min 時達到最大值，30 min 之后多糖得率反而緩慢下降。當超聲波與微波作用于桑黃時間太長，會使桑黃中的多糖成分受到一定的破壞，而使得率降低。提取時間對桑黃子實體多糖得率的影響，試驗結果顯示隨著溫度的逐漸升高，總糖得率逐漸增加。溫度越高提取效果越好，最佳提取溫度選為100 ℃。

按照液料比50 mL/g，提取溫度為100 ℃，以超聲波功率、微波功率、提取時間等作為影響多糖提取率的因素，試驗在單因素試驗的基礎上設計L9（34）正交試驗，進一步研究超聲波微波協同輔助提取桑黃子實體多糖的最優提取工藝參數，正交試驗設計與結果見表2，正交試驗方差分析表見表3。

表2 正交試驗設計與結果Table 2 Results and range analysis of orthogonal array design

表3 正交試驗方差分析表Table 3 Analysis of variance in orthogonal array design

如表2 和表3 所示，顯示試驗顯著性最強的單因素為超聲波功率，其次是提取時間，最后為微波功率。由試驗結果可得超聲波微波輔助提取法的最佳工藝為超聲功率360 W、微波功率100 W、提取時間30 min、液料比50 mL/g 時，多糖得率最高，達10.6%。

在提取過程當中超聲波能夠在提取溶液中產生空穴現象，這種空穴現象可以加速桑黃細胞內多糖成分的快速溶出，另外也要考慮超聲波的次級效應，比如我們非常熟悉的機械振動和化學效應等，這些效應也可以加速桑黃細胞壁多糖的擴散釋放，多糖從真菌組織釋放后超聲波使其充分與溶劑混合。微波可快速穿透桑黃，也可以被桑黃吸收產生熱。所謂的超聲波微波協同技術就是將超聲振動與微波兩種不同的作用方式結合在一起，有效的利用微波的高能作用與超聲波振動的空穴作用，對桑黃進行快速、高效、可靠的提取。與其他提取方法相比，比如熱水提取法，超聲波微波輔助提取法，是基于超聲波和微波場的瞬時穿透性加熱方式，它是一種更有效更快速的提取法，現在它被廣泛應用植物活性物質的提取，被提取組分在微波場作用下迅速產生大量熱能，可加速植物組織內被提取組分由固體內部向固液界面擴散的速率。超聲波微波提取顯著的優于傳統熱水提取法，此項技術有效提高了提取的選擇性，減少了提取時間。傳統熱水提取法和超聲波微波提取法提取多糖后組織的顯微結構，證實超聲波和微波的協同效應對真菌細胞具有膨爆作用。超聲波微波協同條件下真菌多糖的提取是一快速的組織崩解過程，這一過程使提取時間縮短，而且多糖得率也能有效提高，多糖的生物活性也能一定程度的提高[7-8]。

2.2 桑黃多糖活性研究

對熱水法和超聲波微波輔助提取的多糖進行含量測定，熱水法和超聲波微波輔助提取的多糖含量分別為20.1%和21.4%。對熱水法和超聲波微波輔助提取的多糖進行清除DPPH 和清除超氧負離子的活性測定。桑黃多糖對DPPH 的清除率曲線見圖5。

圖5 桑黃多糖對DPPH 自由基的清除率曲線Fig.5 Scavenging curves of the polysaccharides from Phellinus igniarius DPPH free radicals

如圖5 所示，隨著桑黃多糖濃度的逐漸增加，其清除DPPH 自由基的能力增強，而且清除效果與桑黃質量濃度之間存在明顯的量效關系。

桑黃多糖對超氧陰離子清除率曲線見圖6。

如圖6 所示，桑黃多糖清除超氧負離子的能力雖然不及VC，但也呈現很強的抗氧化性。超聲波微波輔助提取桑黃多糖其抗氧化活性顯著高于熱水法提取的多糖。

圖6 桑黃多糖對超氧陰離子清除率曲線Fig.6 Scavenging curves of the polysaccharides from Phellinus igniarius superoxide anion radicals

桑黃多糖質量濃度對Hela 癌細胞的抑制率見圖7。

圖7 多糖質量濃度對Hela 癌細胞的抑制率Fig.7 Effects of different polysaccharide concentrations on inhibitive rate of cancel cell Hela

如圖7 所示，對熱水法和超聲波微波輔助提取的多糖進行抗腫瘤對比試驗可知，桑黃多糖對對人宮頸癌細胞Hela 有較強的細胞毒活性。熱水法提取的桑黃多糖其 IC50值為 0.95 mg/mL，在濃度 1.5 mg/mL 時Hela 的抑制率為60.74%；超聲波微波法提取的桑黃多糖其IC50值為0.81 mg/mL，在濃度1.5 mg/mL 時Hela的抑制率為65.20 %，超聲波微波提取桑黃多糖其抗腫瘤活性更強。陽性對照藥紫杉醇注射液在濃度0.01 mg/mL 時Hela 的抑制率為73.73%。對比紫杉醇注射液，桑黃多糖抗腫瘤活性雖未超過，但也表現出很強的抗腫瘤活性[8-10]。

桑黃多糖質量濃度對HepG2 癌細胞的抑制率見圖8。

從圖8 可知，桑黃多糖對人肝癌細胞HepG2 亦具有一定的細胞毒活性，熱水法提取的桑黃多糖其IC50值為0.79 mg/mL，在濃度1.5 mg/mL 時抑制率為66.01%；超聲波微波法輔助提取的桑黃多糖其IC50值為0.60 mg/mL，在濃度1.5 mg/mL 時抑制率為68.20%，超聲波微波提取桑黃多糖其抗腫瘤活性更強。陽性對照藥紫杉醇注射液在濃度0.01 mg/mL 時HepG2 的抑制率為73.07%。對比紫杉醇注射液，桑黃多糖抗腫瘤活性雖未超過，但也表現出很強的抗腫瘤活性[8-10]。試驗結果表明，超聲波微波輔助提取不但效率高，而且可以提高多糖的活性。

圖8 多糖質量濃度對HepG2 癌細胞的抑制率Fig.8 Effects of different polysaccharide concentrations on inhibitive rate of cancel cell HepG2

3 結論

相比傳統熱水提取法，應用超聲波微波復合法輔助提取桑黃多糖，有效提高了提取率[11-12]，多糖得率最高達到10.6%。正交試驗結果表明不同提取因素對桑黃子實體多糖得率的影響順序為：超聲功率＞提取時間＞微波功率。熱水提取法與超聲波微波輔助提取法，這兩種方法提取的桑黃多糖，進行了抗氧化及抗腫瘤活性研究，發現通過超聲波微波輔助提取的桑黃多糖有較好的抗氧化和抗腫瘤活性[11-12]。