基于不同乳酸菌發酵的黃秋葵酸奶研制及其體外抗氧化研究

汪瑞敏，趙衛紅，孫大利，李博巖，張清海，周艷，徐良

（1.貴州醫科大學公共衛生學院，貴州貴陽550025；2.貴州醫科大學食品科學學院，貴州貴陽550025；3.海南大學食品科學與工程學院，海南?？?70100；4.貴州醫科大學貴州省食品質量與安全科技服務平臺，貴州貴陽550025；5.貴州醫科大學環境污染與疾病監控省部共建教育部重點實驗室，貴州貴陽550025；6.貴州民族大學人文科技學院，貴州貴陽550025）

黃秋葵，又名黃葵、羊豆角、補腎菜，屬錦葵科、秋葵屬，是一種分布在亞熱帶以及熱帶的草本植物[1-2]。黃秋葵的嫩果中含有豐富的蛋白質、維生素、膳食纖維、礦物質、黃酮及多糖等成分。黃秋葵具有疏通腸道、開胃的功能，長時間食用黃秋葵可以助消化、調和脾胃，對胃炎、肝臟等疾病都有一定的療效。黃秋葵水提液中含有果膠和黏性蛋白糖高分子為主要成分的聚合體[3-6]，可被用作天然食品增稠劑、乳化劑和穩定劑[7-9]。黃秋葵的水提液在生物活性功效方面被發現可以促進腸胃蠕動、預防便秘、增強人體的耐力，補充能量。同時，黃秋葵中的膳食纖維可以促進體內有機物質進行排泄。適量食用可以降低人體的血清膽固醇，減少體內毒素的積累，可以有效預防心血管疾病的發生[10-11]。

乳酸菌是一類對人體十分有益的菌群，其在發酵過程中能夠產生大量的有機酸、醇類及各種氨基酸等代謝物，具有抑制腐敗菌、提高消化率等生理功效。乳酸菌發酵食品中的營養成分較高，乳酸菌進入人體以后，能將腸道中的細菌和雜質分解，產生乳酸和抗菌物質，促進腸道菌群平衡[12]。從醫學的角度來看乳酸菌可以促進體內雜質和致癌物質的分解[13]。乳酸菌不僅能夠清除體內產生的自由基[14]，并且乳酸菌發酵以后可以增強發酵液清除自由基的能力，有研究報道乳酸菌發酵能夠顯著提高櫻桃[15]、卷心菜[16]等發酵液中總酚含量及其抗氧化活性，并且選擇不同的乳酸菌菌種發酵，對桂圓肉中酚類物質釋放及抗氧化能力有顯著差異[17]。也有研究報道乳酸菌發酵的果蔬酸奶可以明顯提高強酸奶的抗氧化活性，可改善其風味及口感[18]。

酸奶是以鮮奶作為原料，經過巴氏殺菌后并添加純乳酸菌種，再經過發酵、冷卻灌裝制成的奶制品。酸奶比鮮奶及各種奶粉營養價值更高。發酵過程某些菌種使奶中20%的乳糖、蛋白質被水解成為小分子，提高營養物質的利用率。鮮奶中的脂肪含量在3%～5%之間。經發酵后，乳制品中的脂肪酸能達到原料奶中的2 倍，使酸奶比鮮奶更容易被人體消化和吸收[19-21]。特別是對患有乳糖消化不良的人來說，喝酸奶不會導致腹脹腹瀉。酸奶中還含有豐富的活性乳酸菌和短鏈脂肪酸，可以促進腸道蠕動，治療便秘。發酵后牛奶中的鈣和其他礦物質都沒有發生改變，但牛奶發酵后產生的乳酸能夠有效地提高鈣、磷在人體內的利用率，所以人體更容易吸收酸奶之中的鈣磷。

本文選擇單一菌種（保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌其一）作為發酵劑，探究不同發酵劑、不同黃秋葵汁添加量等因素，對黃秋葵酸奶的品質及抗氧化活性的影響，以期望在豐富黃秋葵的加工利用以外，為黃秋葵酸奶在不同乳酸菌發酵后增強了其清除自由基能力提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸奶發酵劑（保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌）、黃秋葵：市售；碳酸鈉、無水乙醇、磷酸、硫酸亞鐵、雙氧水、沒食子酸、甲醇、氯化鋁、乙酸鉀：均為分析純，國藥集團化學試劑北京有限公司；DPPH（98%）：梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；鄰菲羅啉（99%）：成都金山化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

智能生化培養箱（SHP-160）：上海三發科學儀器有限公司；破壁機（JYL-Y912）：九陽股份有限公司；冷凍離心機（TGL20M）：長沙邁佳儀器設備有限公司；紫外分光光度計（T6）：上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃秋葵汁制備

黃秋葵去蒂清洗，并放入沸水中熱燙2 min 后晾干。用破壁機將黃秋葵與蒸餾水按質量比1 ∶3 進行榨汁，之后過濾（60 目），獲得黃秋葵汁液置于冰箱備用。

1.3.2 工藝流程

原料混合（黃秋葵汁、白糖、純牛奶）→均質→滅菌→冷卻→接種→灌裝→封口→保溫發酵→冷藏后熟→成品

1.3.3 單因素試驗

1）白砂糖添加量的選擇

以50 g 純牛奶為標準，發酵溫度為42 ℃，發酵時間4 h，黃秋葵汁添加量8%，保加利亞乳桿菌接種量3%，分別添加（5%、6%、7%、8%）的白砂糖，研究不同白砂糖添加量對黃秋葵酸奶品質的影響。

2）黃秋葵汁添加量的選擇

以50 g 純牛奶為標準，發酵溫度為42 ℃，發酵時間4 h，白砂糖添加量6 %，保加利亞乳桿菌接種量3 %，分別添加（5%、6%、7%、8%）的黃秋葵汁，研究不同黃秋葵汁添加量對與黃秋葵酸奶品質的影響。

3）發酵時間的選擇

以50 g 純牛奶為標準，發酵溫度為42 ℃，白砂糖添加量6%，黃秋葵汁添加量8%，保加利亞乳桿菌接種量 3%，分別發酵（3、4、5、6 h），研究不同發酵時間對與黃秋葵酸奶品質的影響。

1.3.4 正交試驗

為了進一步優化黃秋葵酸奶的工藝，以黃秋葵汁添加量，白砂糖添加量，發酵時間，乳酸菌種類作為試驗因素，在單因素試驗基礎上設計四因素三水平正交試驗，以抗氧化能力及感官評分標準為指標對酸奶的功能性、組織狀態，風味，口感進行評分。正交因素水平表如表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5 感官評分

以10 名具備食品專業及酸奶感官評價背景的學生對酸奶成品進行感官評分。分數統計取各分數的平均值，評分標準見表2。

表2 感官評分標準Table 2 Sensory score sheet of okra yogurt

1.3.6 體外抗氧化試驗

1）DPPH 自由基清除能力

取8 mL 0.1 mmoL/L DPPH 乙醇溶液與2 mL 酸奶樣品溶液或95%乙醇（空白對照）混合，充分振蕩后室溫（25 ℃）下暗處反應30 min。接著混合樣品在以4 ℃，5 000 r/min 離心 10 min 后，于 515 nm 處測定上清液的吸光度值[22]。DPPH·清除率（%）按照式（1）計算：

式中：A0為空白吸光值；A1為樣品吸光值。

2）羥基自由基（·OH）的清除能力

5×10-3mol/L 鄰菲啰啉溶液 1.5 mL 與 2.0 mL、0.05 mol/L、pH 7.4 磷酸緩沖液混合均勻后，加入1.0 mL、7.5×10-3mol/L FeSO4溶液，混勻后再加入 1 mL、0.1%H2O2，以蒸餾水定容至 10 mL，37 ℃溫育 1 h 后，在536 nm 下測A2。依據上述方法，分別測定不同酸奶樣品的 A1；不加 H2O2樣品溶液的為 A0?！H 清除率（%）按照式（2）計算[23]：

1.3.7 數據分析

采用SPSS 17.0 軟件分析試驗數據，平均值的差異性用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）中的最小顯著差異法（least significant difference，LSD）檢驗，P＜0.05 為有統計學差異。所有試驗重復3 次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發酵時間對酸奶品質的影響

發酵時間對酸奶中的酸度形成十分重要，因此在單因素試驗中，對發酵時間進行優化，結果見圖1。

圖1 發酵時間對酸奶品質的影響Fig.1 Effect of fermentation time on yogurt quality

由圖1 可知，酸奶的品質隨著發酵時間的延長，感官評分呈上升，當發酵時間為5 h 時感官評分達到最高，此時的酸奶組織狀態均勻穩定、口感良好，酸奶的品質最佳。繼續發酵到下去到6 h 時，感官評分下降，酸奶的酸度增加，酸甜比失調。酸奶口感變差，酸奶品質不佳。

2.1.2 白砂糖添加量對酸奶品質的影響

白砂糖可以調和由乳酸菌發酵產生的尖酸味，對酸奶的口感十分重要，白砂糖添加量對酸奶品質的影響見圖2。

圖2 白砂糖添加量對酸奶品質的影響Fig.2 Effect of sugar addition on yogurt quality

由圖2 可知，酸奶的品質隨著白砂糖的添加量的增加感官評分上升，當白砂糖添加量達到到6%時感官評分達到最高，酸奶的組織狀態均勻穩定、口感良好，酸奶的品質達到最佳。當白砂糖添加量繼續增加到8%后。酸奶的感官評分降低，酸奶口感變膩。酸奶中白砂糖添加量過低時導致酸奶酸味較重，如果白砂糖添加量繼續增加就會使酸奶口感變差，有甜膩的感覺。

2.1.3 黃秋葵添加量對酸奶品質的影響

黃秋葵汁液添加量會影響酸奶的口感、風味、色澤，因此需要單因素試驗進行優化，結果見圖3。

圖3 黃秋葵添加量對酸奶品質的影響Fig.3 Effect of the addition of yellow okra on the quality of yogurt

由圖3 可知，開始酸奶的品質隨著黃秋葵汁添加量的增加感官評分上升，當黃秋葵汁添加量達到6%時感官評分達到最高。酸奶的組織狀態均勻穩定、口感良好，酸奶的品質達到最佳。繼續增加黃秋葵汁添加量后感官評分降低，酸奶中黃秋葵的氣味明顯，但口感變差，食用后舌頭發麻，黃秋葵汁液添加量越多舌頭發麻感覺越明顯。

2.2 正交試驗

在單因素試驗基礎上，進行L9（34）正交試驗，其正交試驗結果表3。

表3 正交試驗結果Table 3 Orthogonal test results

由表3 的正交試驗結果和極差分析可知，RB＞RC＞RD＞RA，影響黃秋葵酸奶品質的因素主要是黃秋葵汁液的添加量，其次是菌種種類和白砂糖的添加量，影響最低的是發酵時間，由從以上可以得出本次試驗當中黃秋葵酸奶的最佳配方是A2B2C3D2，即白砂糖添加量5%，黃秋葵汁添加量6%，菌種植物乳酸菌，發酵時間4h。該組合條件下進行了3 次重復驗證試驗，所得的黃秋葵酸奶感官評分品均值90 分，高于其它組合。

2.3 體外抗氧化試驗

用植物乳酸菌（3%）在42 ℃，白砂糖添加量5%，發酵4 h 得到對照組酸奶；植物乳酸菌（3%），白砂糖添加量5%，黃秋葵汁添加量6%，在42 ℃發酵4 h 得到黃秋葵酸奶。

2.3.1 DPPH 自由基清除能力

黃秋葵酸奶的DPPH·清除能力見圖4。

圖4 黃秋葵酸奶的DPPH·清除能力Fig.4 Clear ability on DPPH·of okra yogurt

DPPH 自由基是非常有效的自由基捕獲劑，經常被用于檢測樣品清除自由基的能力，DPPH 自由基乙醇溶液呈紫色，最大吸收波長為515 nm。如果有其它物質提供一個電子使此孤電子被配對，吸收消失或者減弱，導致溶液顏色變淺，在515 nm 處的吸光度變小，其變化程度與自由基清除程度呈線性關系。故該法可以用來表征某種物質對自由基的清除能力，通常用清除率表示。清除率越大，表明該物質對自由基的清除能力越強[24]。如圖4 所示，黃秋葵酸奶對DPPH·清除率均大于對照組酸奶，且清除率隨著酸奶濃度的增大而增大。通過單因素方差分析，在相同酸奶濃度條件下，黃秋葵酸奶對DPPH·的清除率顯著高于對照組酸奶（P＜0.01），且在樣品濃度 50 mg/mL 時，兩者間的清除率差異最大。

2.3.2 羥基自由基（·OH）的清除能力

黃秋葵酸奶的·OH 清除能力見圖5。

圖5 黃秋葵酸奶的·OH 清除能力Fig.5 Clear ability on·OH of okra yogurt

·OH 是目前對生物體危害最大的自由基，可以與生物體內的多種分子作用，造成核酸、蛋白質、氨基酸和脂類等物質的發生氧化損傷，導致細胞壞死或產生突變，進而引起某些疾病。如圖5 所示，黃秋葵酸奶對·OH 清除率均大于對照組酸奶，且對·OH 清除率隨酸奶濃度的增大而增大。通過單因素方差分析，在相同酸奶濃度條件下，黃秋葵酸奶對·OH 的清除率顯著高于對照組酸奶（P＜0.01），且在樣品濃度40 mg/mL 時，兩者間的清除率差異最大。

黃秋葵汁液中含有黃酮、多酚、多糖等抗氧化物質，能明顯提高酸奶的抗氧化能力。并且植物乳酸菌發酵時，釋放的更多得抗氧化物質，可以有效提高酸奶的抗氧化能力[17，25-26]。

3 結果與討論

以植物乳酸菌作為發酵菌種，白砂糖添加量5%，黃秋葵汁添加量6%，發酵時間4 h。該組合條件下進行了3 次重復驗證試驗，所得的黃秋葵酸奶感官評分品均值90 分，所得到的產品呈無色、表面光滑、無乳清析出、酸甜適度、口感細膩、具有淡淡的黃秋葵清香，對DPPH·和·OH 的清除能力明顯高于普通酸奶。但是不同菌種發酵引起酸奶的抗氧化能力增強的機制有待深入研究。