松毛菇多酚的提取及純化工藝研究

黃艷，孫怡婷，張見明，王昕岑，楊宇華

（1.武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，福建武夷山354300；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

松毛菇（Lyopyllum cinerascens），亦稱灰離褶傘、松毛菌，為擔(dān)子菌綱、傘菌目、口蘑科、離褶傘屬，其喜秋季群生于林中地上，廣泛分布于我國黑龍江、吉林、青海及福建北部地區(qū)。人工栽培成功后，因栽培原料比其它木菌類更廣泛，成本更低[1]，因此松毛菇資源十分豐富。目前松毛菇收獲后除鮮食外，大部分被制成干菇、罐頭等加工品，尚未見對松毛菇中天然有效成分開發(fā)利用的研究報道。

多酚類化合物是廣泛存在于植物中的一類活性物質(zhì)[2]，不僅具有較強(qiáng)的抗氧化作用[3]，還具有抗炎抑菌[4]、抗癌[5]、抗老化[6]、降血壓和預(yù)防心血管疾病[7]等功效，因此近年來關(guān)于多酚類物質(zhì)的研究引起了研究者的廣泛興趣[8]。多酚類物質(zhì)的提取方法較多，其中溶劑提取法是應(yīng)用最廣泛也是最傳統(tǒng)的方法[9]，但該法存在提取時間長易致酚類物質(zhì)氧化、提取率低等缺陷，而超聲波輔助溶劑提取則能夠很好地克服以上不足，但該法提取獲得的粗多酚中仍含有較多雜質(zhì)，影響多酚純度及后續(xù)抗氧化抑菌效果的研究，因此有必要對粗多酚進(jìn)行純化。大孔吸附樹脂法通過分子間范德華力和氫鍵形成吸附作用，再通過溶劑洗脫進(jìn)行解吸，從而實現(xiàn)對目標(biāo)物的分離純化[7]。因該法具有操作簡便、吸附速度快、吸附量大、選擇性好、所得樣品純度高等優(yōu)點[5，10]，近年來在天然多酚等功能性成分的分離純化中得到普遍應(yīng)用。松毛菇中含有豐富的多酚類物質(zhì)，且具有多重生物活性，因此將其作為功能活性物質(zhì)加以開發(fā)利用對于松毛菇產(chǎn)業(yè)升值和高值化利用具有長遠(yuǎn)的戰(zhàn)略發(fā)展意義。

本研究利用超聲波輔助溶劑法提取松毛菇多酚，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，應(yīng)用大孔樹脂法對粗提多酚進(jìn)行分離純化并優(yōu)化其純化工藝，旨在為松毛菇多酚的開發(fā)利用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松毛菇：武夷山食用菌技術(shù)開發(fā)有限公司。將松毛菇置于恒溫干燥箱中在45 ℃下干燥5 h，粉碎后過40 目篩，備用。

無水乙醇、福林酚、無水碳酸鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：分析純，上海展云化工有限公司；X-5、D101、HPD600、AB-8、S-8 大孔吸附樹脂：上海摩速科學(xué)器材有限公司，具體物理性能見表1。

表1 大孔樹脂物理性能Table 1 Physical property of macroporous resin

1.2 儀器與設(shè)備

FW80 型高速萬能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；DHG-9075A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、Neofuge23R臺式離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器有限公司；SHZ-DS-111型循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；UV-6100 型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；JA2003 型電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；LGJ-10D 型冷凍干燥機(jī)：湖南湘怡實驗儀器開發(fā)有限公司；SHY-2 型水浴恒溫振蕩器：常州市萬豐儀器制造有限公司；PB-10 型pH 計：廣州市一可實驗設(shè)備有限公司；RE200A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HL-2 型恒流泵、BS-100A 型自動部分收集器：上海滬西分析儀器廠有限公司；WP-UP-UV-20 型超純水機(jī)：四川沃特爾科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 松毛菇多酚提取工藝流程

松毛菇粉末→精確稱量→加入一定濃度乙醇溶液→超聲波輔助提取→抽濾→離心→取上清液→測吸光值

1.3.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參照徐輝艷等[11]的測定方法——福林酚法并作調(diào)整。精確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.005 g，去離子水溶解后置于50 mL 棕色容量瓶中，定容制得0.1mg/mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確量取 0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mL標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL 棕色容量瓶中，各加適量去離子水搖勻后分別加入0.5 mL 福林酚試劑，充分搖勻。1 min 后加入20%碳酸鈉溶液1.5 mL，搖勻定容，于75 ℃水浴下避光反應(yīng)30 min，冷卻至25 ℃左右后在波長760 nm下測定吸光值。以去離子水為空白對照，每個樣品平行測定3 次。以沒食子酸的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]，得到多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.045 4X+0.009 1，R2=0.997 1。

1.3.3 多酚提取量計算

將1.3.1 獲得的提取液稀釋一定倍數(shù)，根據(jù)1.3.2相關(guān)操作，測定其在760 nm 處的吸光值，根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算出松毛菇多酚提取量。計算公式如式（1）所示：

式中：M 為多酚提取量，mg/g；C 為待測液總酚質(zhì)量濃度，μg/mL；V 為提取液總體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；W 為原料質(zhì)量，g。

1.3.4 松毛菇多酚提取單因素試驗

準(zhǔn)確稱取數(shù)份1.00 g 松毛菇粉末，以多酚提取量為評價指標(biāo)，研究液料比、提取時間、提取溫度、超聲功率、乙醇濃度及提取次數(shù)對松毛菇多酚提取效果的影響。液料比分別為 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），提取時間分別為 30、40、50、60、70 min，提取溫度分別為 50、55、60、65、70 ℃，超聲功率分別為 200、250、300、350、400 W，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，提取次數(shù)分別為1、2、3 次。以上每組試驗平行測定3 次。

1.3.5 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗設(shè)計

基于單因素試驗結(jié)果，根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計原理，選取對松毛菇多酚提取效果影響較大的液料比、提取溫度、乙醇濃度為考察因素，以多酚提取量為響應(yīng)值，利用Design Expert.V8.0.6 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計，確定松毛菇多酚的最佳提取工藝。試驗因素水平及編碼見表2。

表2 試驗因素水平及編碼Table 2 Test factor levels and codes

1.3.6 大孔樹脂預(yù)處理

稱取一定質(zhì)量1.1 所述的5 種樹脂，用95%乙醇溶液浸泡24 h，傾倒去除乙醇中上浮的碎屑，更換95 %乙醇溶液繼續(xù)浸泡，直到浸泡液加水不產(chǎn)生混濁，再用1 mol/L 稀HCl 溶液浸泡8 h，除去樹脂中酸溶性雜質(zhì)，用去離子水沖洗大孔樹脂至中性，再用1 mol/L稀NaOH 溶液浸泡8 h，除去樹脂中堿溶性雜質(zhì)，用去離子水沖洗樹脂至其呈中性，備用。

1.3.7 最適大孔樹脂篩選

松毛菇粗提物的制備：采用響應(yīng)面法獲得的最佳提取工藝制得松毛菇多酚提取液，待其冷卻、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后經(jīng)真空冷凍干燥得到深褐色膏狀多酚粗提物。后續(xù)試驗可根據(jù)需要配制成相應(yīng)濃度。

分別準(zhǔn)確稱取預(yù)處理的5 種濕樹脂1.0 g 置于三角錐瓶中，分別加入濃度為0.6 mg/mL 的松毛菇粗提液20 mL，在25 ℃恒溫下于振蕩器中150 r/min 轉(zhuǎn)速下充分振蕩12 h，過濾，測定濾液的吸光值，根據(jù)回歸方程計算多酚提取量，再參照公式（2）和式（3）計算吸附量、吸附率[13]。

式中：C0為粗提液中多酚濃度，mg/mL；C1為吸附平衡時吸附液中多酚濃度，mg/mL；V1為樣品溶液體積，mL；W 為大孔樹脂濕重，g。

待5 種樹脂達(dá)到吸附平衡狀態(tài)，用去離子水沖洗樹脂直至其表面無吸附溶液殘留，然后用濾紙擦干樹脂表面的去離子水，再將不同樹脂分別置于5 個錐形瓶中，各加入30 mL 95%乙醇溶液，在25 ℃恒溫下于振蕩器中150 r/min 轉(zhuǎn)速下充分振蕩12 h，解吸完全后過濾，測定濾液的吸光值，根據(jù)回歸方程計算多酚提取量，并按式（4）計算解吸率[14]。

式中：C2為解吸平衡時解吸液多酚濃度，mg/mL；V2為洗脫溶液體積，mL；W 為大孔樹脂重量，g；Q 為吸附量，mg/g。

選取吸附及解吸性能均佳的大孔樹脂進(jìn)行后續(xù)純化工藝研究。

1.3.8 最適大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸試驗

1.3.8.1 靜態(tài)吸附曲線繪制

準(zhǔn)確稱取1.0 g D101 大孔樹脂，置于50 mL 錐形瓶中，加入0.6 mg/mL 的松毛菇多酚粗提液20 mL，再置于恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速設(shè)為150 r/min，在25 ℃恒溫下充分振蕩12 h 至吸附平衡，每經(jīng)1 h 吸取一定量的上清液，測定吸附液的多酚濃度，計算吸附量和吸附率，繪制靜態(tài)吸附曲線。

1.3.8.2 吸附液pH 值的確定

準(zhǔn)確稱取7 份1.0 g D101 大孔樹脂，分別置于7個50 mL 錐形瓶中，各加入 0.6 mg/mL pH 值為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的松毛菇多酚粗提液 20 mL，在25 ℃恒溫下于振蕩器中150 r/min 的轉(zhuǎn)速下充分振蕩12 h，待其吸附平衡后，用移液管準(zhǔn)確吸取一定量的上清液，測定吸附液中多酚濃度，計算吸附率。

1.3.8.3 洗脫劑乙醇濃度的確定

將吸附飽和的D101 大孔樹脂過濾后用去離子水洗滌，用濾紙輕輕拭干樹脂表面水分。準(zhǔn)確稱取5 份1.0 g 大孔樹脂，分別裝入5 個50 mL 錐形瓶中，再分別加入體積分?jǐn)?shù)為10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液各30 mL，在25℃恒溫下于振蕩器中150 r/min的轉(zhuǎn)速下充分振蕩12 h，用移液管準(zhǔn)確吸取一定量的上清液，測定其中多酚濃度，計算解吸率。

1.3.9 最適大孔樹脂動態(tài)吸附和解吸試驗

1.3.9.1 上樣流速的確定

將充分活化并瀝干的D101 大孔濕樹脂裝入玻璃柱中，自然沉降。將pH 3.0、0.6 mg/mL 的多酚粗提液分別以 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min 的流速上柱，每 4 mL收集1 管流出液，當(dāng)流出液中多酚濃度達(dá)到上樣濃度的1/10 時，即開始出現(xiàn)泄露，說明大孔樹脂已經(jīng)吸附飽和[15]，停止吸附，用去離子水以1 mL/min 的速度沖洗，收集洗脫液，測定溶液中多酚濃度，計算吸附率。

1.3.9.2 上樣濃度的確定

同1.3.9.1 方法裝柱。配制pH 3.0，濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL 的多酚吸附液，以 0.5 mL/min流速上柱，每4 mL 收集1 管流出液。當(dāng)樹脂吸附飽和時停止吸附，用去離子水以1 mL/min 的速度沖洗，收集洗脫液，測定溶液中多酚濃度，計算吸附率。

1.3.9.3 洗脫流速的確定

同1.3.9.1 方法裝柱。配制pH 3.0、0.8 mg/mL 的多酚吸附液，以0.5 mL/min 流速上柱，當(dāng)樹脂吸附飽和時停止吸附，用去離子水沖洗，再用50%乙醇溶液分別以 l、1.5、2、2.5、3 mL/min 的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測定溶液中多酚濃度，計算洗脫率。

1.3.9.4 洗脫劑用量的確定

同1.3.9.1 方法裝柱。配制pH 3.0、0.8 mg/mL 的多酚吸附液，以0.5 mL/min 流速上柱，當(dāng)樹脂吸附飽和時停止吸附，用去離子水沖洗，再用50 %乙醇溶液以1 mL/min 的洗脫流速進(jìn)行解吸，收集洗脫液并測定其中多酚濃度，繪制D101 大孔吸附樹脂在不同洗脫劑用量下對多酚的解吸效果曲線。

1.3.10 松毛菇多酚純化效果評價

利用最佳純化工藝對松毛菇多酚粗提液吸附純化，純化液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、真空冷凍干燥后獲得多酚純化物，取適量配置成一定濃度溶液，測定其吸光度值，計算純化多酚含量，并與純化前多酚含量進(jìn)行對比，評價其純化效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 松毛菇多酚提取單因素試驗結(jié)果

2.1.1 液料比對松毛菇多酚提取量的影響

液料比對松毛菇多酚提取量的影響見圖1。

圖1 液料比對松毛菇多酚提取量的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on the extraction amount of polyphenols from Lyopyllum cinerascens

由圖1 可知，松毛菇多酚提取量隨液料比的增加呈先增大后減小的變化，液料比為20 ∶1（mL/g）時對應(yīng)的提取量最大。在一定的液料比范圍內(nèi)，液料比增大使得松毛菇粉末顆粒與乙醇溶液的接觸面積增加，提高了多酚向溶劑擴(kuò)散的傳質(zhì)速率，因此提取量增加[16]。繼續(xù)增大液料比，雜質(zhì)含量亦會隨之增加，既影響多酚提取[17]，又增加提取成本。因此液料比優(yōu)選 20 ∶1（mL/g）。

2.1.2 提取時間對松毛菇多酚提取量的影響

提取時間對松毛菇多酚提取量的影響見圖2。

圖2 提取時間對松毛菇多酚提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction amount of polyphenols from Lyopyllum cinerascens

由圖2 可知，松毛菇多酚提取量隨提取時間延長呈先上升后降低的趨勢，超聲60 min 時提取量最高，隨后提取量降低。在一定時間范圍內(nèi)，提取時間越長，松毛菇顆粒被溶劑浸透越充分，且超聲波空化作用及機(jī)械效應(yīng)的持續(xù)作用加速了多酚向溶劑溶出[18]；當(dāng)提取時間過長，超聲波的剪切作用會破壞多酚類物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，同時導(dǎo)致熱敏成分的降解轉(zhuǎn)化及溶劑揮發(fā)，從而影響提取效果[17]。因此提取時間優(yōu)選60 min。

2.1.3 提取溫度對松毛菇多酚提取量的影響

提取溫度對松毛菇多酚提取量的影響見圖3。

圖3 提取溫度對松毛菇多酚提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction amount of polyphenols from Lyopyllum cinerascens

由圖3 可知，類似提取時間的影響，松毛菇多酚提取量隨提取溫度升高亦呈先增加后降低的趨勢，65 ℃時提取量達(dá)到最大值。高溫使細(xì)胞壁滲透性增強(qiáng)，同時增加提取物的溶解度及擴(kuò)散系數(shù)，降低溶劑的黏度，使得提取量增加[19]；但溫度過高會引起酚類化合物發(fā)生降解、氧化及聚合反應(yīng)，同時易造成溶劑揮發(fā)損失及松毛菇中其它成分的溶解度增大，從而引起多酚提取量下降[20]。因此提取溫度優(yōu)選65 ℃。

2.1.4 超聲功率對松毛菇多酚提取量的影響

超聲功率對松毛菇多酚提取量的影響見圖4。

圖4 超聲功率對松毛菇多酚提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction amount of polyphenols from Lyopyllum cinerascens

由圖4 可知，隨超聲功率增大，多酚提取量亦增大，超聲功率為250 W 時，多酚提取量最大，繼續(xù)提高超聲功率，多酚提取量則不斷降低。超聲波對細(xì)胞壁的破碎作用隨超聲功率增大而增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)多酚類物質(zhì)溶出速率增加，提取量隨之提高；當(dāng)功率超過一定值時，由于多酚類化合物在乙醇溶液中已飽和，且過大的超聲強(qiáng)度會破壞多酚類化合物的結(jié)構(gòu)[21]，使得提取量降低。因此超聲功率優(yōu)選250 W。

2.1.5 乙醇濃度對松毛菇多酚提取量的影響

乙醇濃度對松毛菇多酚提取量的影響見圖5。

圖5 乙醇濃度對松毛菇多酚提取量的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the extraction amount of polyphenols from Lyopyllum cinerascens

由圖5 可知，當(dāng)乙醇濃度為50%～70%時，乙醇濃度越大，多酚提取量亦越大，70%對應(yīng)的多酚提取量達(dá)到最大值。當(dāng)乙醇濃度大于70%時，多酚提取量降低。分析原因可能是乙醇濃度較低時，提取液中蛋白質(zhì)等水溶性物質(zhì)溶出多，雜質(zhì)含量較多；乙醇濃度增加至一定程度，溶液的極性增強(qiáng)，松毛菇中的色素、脂溶性成分及黏性物質(zhì)等大量析出[22]，這些成分與多酚類物質(zhì)形成競爭關(guān)系，從而影響了多酚類物質(zhì)的溶出。因此乙醇濃度優(yōu)選70%。

2.1.6 提取次數(shù)對松毛菇多酚提取量的影響

提取次數(shù)對松毛菇多酚提取量的影響見圖6。

圖6 提取次數(shù)對松毛菇多酚提取量的影響Fig.6 Effect of extraction times on extraction amount of polyphenols from Lyopyllum cinerascens

由圖6 可知，經(jīng)1 次超聲提取，松毛菇中的多酚類化合物基本被浸出，隨著提取次數(shù)的增加，多酚提取量并未明顯提高，且經(jīng)3 次提取提取量反而降低。為節(jié)約成本、縮短時間和降低能耗，以及多次提取可能造成多酚損失，因此提取次數(shù)優(yōu)選1 次。

2.2 松毛菇多酚提取工藝響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)模型建立與分析

響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Box-Behnken experiment design and result

應(yīng)用Design Expert.V8.0.6 對表3 中試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，建立提取條件和多酚提取量之間的二次多項式模型為：

對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表4 二次回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of quadratic regression model

由表4 可知，該回歸模型P 值為0.002＜0.01，說明模型回歸極顯著，失擬項P 值為0.188 9＞0.05，呈不顯著性。該模型R2=0.967 4，R2Adj=0.925 4，說明該模型與試驗擬合度好，可用于松毛菇多酚提取量的預(yù)測分析。X1、X1X3、X12、X32對松毛菇多酚提取量影響均呈極顯著水平（P＜0.01），X2、X3、X2X3、X22對松毛菇多酚提取量影響均呈顯著水平（P＜0.05）。各因素對松毛菇多酚提取量的影響大小依次為：X1（液料比）＞X3（乙醇濃度）＞X2（提取溫度）。

2.2.2 各因素間交互作用分析

各因素交互作用對松毛菇多酚提取量的影響見圖7。

響應(yīng)面圖直觀地反映液料比、提取溫度及乙醇濃度之間的交互作用及其對多酚提取量的影響。由圖7可知，液料比和乙醇濃度的交互作用對多酚提取量呈極顯著影響（P＜0.01）、提取溫度和乙醇濃度的交互作用對多酚提取量呈顯著影響（P＜0.05），液料比和提取溫度的交互作用對多酚提取量影響不顯著。

圖7 各因素交互作用對松毛菇多酚提取量的影響Fig.7 Effects of interaction of various factors on the extraction amount of polyphenols from Lyopyllum cinerascens

2.2.3 模型驗證及最佳提取工藝條件確定

通過回歸模型預(yù)測，得出超聲波輔助乙醇提取松毛菇多酚的最佳工藝條件為：液料比21.58 ∶1（mL/g）、提取溫度66.51 ℃、乙醇濃度71.09%，此條件下多酚最大提取量預(yù)測值為14.62 mg/g。考慮實際可操作條件，將提取條件調(diào)整為液料比 22 ∶1（mL/g）、提取溫度67 ℃、乙醇濃度71%。在此條件下進(jìn)行3 次平行驗證試驗，得到多酚提取量為14.60 mg/g，與理論預(yù)測值相對誤差約為0.14%，表明利用響應(yīng)面法建立的回歸模型可較好地預(yù)測松毛菇多酚的實際提取量。

2.3 松毛菇多酚純化工藝研究結(jié)果

2.3.1 最適大孔吸附樹脂的確定

5 種大孔樹脂對松毛菇多酚的吸附效果比較見表5。

表5 5 種大孔樹脂對松毛菇多酚的吸附效果比較Table 5 Comparison of adsorption effects of five macroporous resins for polyphenols from Lyopyllum cinerascens

由表5 可知，S-8 樹脂的吸附率最高，D101 和AB-8 次之，X-5 和HPD600 的吸附率較低，均低于80%，HPD600、D101、X-5 樹脂的解吸率較高，均高于 90%。大孔樹脂對化合物的分離純化既要考慮其吸附能力，亦要考察其洗脫能力[23]，從而保證最大限度地回收有效成分。綜合吸附及解吸效果，確定D101 樹脂為純化松毛菇多酚的最適樹脂，后續(xù)試驗將考察該樹脂對松毛菇多酚的靜態(tài)及動態(tài)吸附和解吸工藝。

2.3.2 D101 大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸效果分析

2.3.2.1 D101 大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線繪制

D101 大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線見圖8。

圖8 D101 大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線Fig.8 Static adsorption kinetic curve of D101 macroporous resin

由圖8 可知，松毛菇多酚溶液吸附率隨吸附時間延長不斷升高，4 h 后吸附曲線趨于平緩，說明此時樹脂吸附基本處于飽和狀態(tài)。因此選取4 h 為松毛菇多酚靜態(tài)吸附的最佳時間。

2.3.2.2 pH 值對D101 大孔樹脂吸附效果的影響

粗提液pH 值對D101 大孔樹脂吸附效果的影響見圖9。

圖9 粗提液pH 值對D101 大孔樹脂吸附效果的影響Fig.9 Effect of pH value of crude extract on adsorption of D101 macroporous resin

由圖9 可知，D101 大孔樹脂對松毛菇多酚的吸附率隨pH 值升高呈先增加后降低的趨勢，pH 值為3 時吸附率最大，為77.46%。在酸性條件下，多酚常以分子狀態(tài)存在，通過范德華力與樹脂吸附，因此易被吸附；在堿性條件下，多酚分子羥基去離子化后形成離子型結(jié)構(gòu)，因此不易被吸附[24]。綜上，多酚粗提液pH 值優(yōu)選3。

2.3.2.3 乙醇濃度對D101 大孔樹脂解吸效果的影響

乙醇濃度對D101 大孔樹脂解吸效果的影響見圖10。

圖10 乙醇濃度對D101 大孔樹脂解吸效果的影響Fig.10 Effect of ethanol concentration on desorption of D101 macroporous resin

由圖10 可知，乙醇溶液作為洗脫劑對樹脂具有較好的解吸效果。當(dāng)乙醇濃度為10%～50%時，樹脂的解吸能力隨乙醇濃度的增大而不斷提高；當(dāng)乙醇濃度超過50%時，解吸率增加不明顯。由于多酚與樹脂間存在強(qiáng)烈的氨鍵作用，吸附于樹脂上的多酚不易被水和低濃度的乙醇洗脫下來[25]。考慮解吸效果及乙醇濃度過高揮發(fā)性大影響試驗操控，因此洗脫劑乙醇濃度優(yōu)選50%。

2.3.3 D101 大孔樹脂動態(tài)吸附及解吸效果分析

2.3.3.1 上樣流速對D101 大孔樹脂吸附效果的影響

上樣流速對D101 大孔樹脂吸附效果的影響見圖11。

圖11 上樣流速對D101 大孔樹脂吸附效果的影響Fig.11 Effect of sample velocity on adsorption of D101 macroporous resin

上樣流速是影響多酚分離效果的關(guān)鍵因素。由圖11 可知，隨上樣流速增大，多酚吸附率不斷降低，上樣流速越慢，大孔樹脂對多酚的吸附率越高。由于上樣流速較小時，樹脂易于吸附多酚，上樣流速越大，吸附液中多酚物質(zhì)未能擴(kuò)散到樹脂內(nèi)部而被沖出柱外，導(dǎo)致樹脂對多酚吸附率降低[26]。當(dāng)上樣流速低于0.5 mL/min，上樣時間過長，分離效率低，且實際操作時恒流泵較難控制，因此上樣流速優(yōu)選0.5mL/min。

2.3.3.2 上樣濃度對D101 大孔樹脂吸附效果的影響

上樣濃度對D101 大孔樹脂吸附效果的影響見圖12。

圖12 上樣濃度對D101 大孔樹脂吸附效果的影響Fig.12 Effect of sample concentration on adsorption of D101 macroporous resin

由圖12 可知，當(dāng)上樣濃度為0.5 mg/mL～0.8 mg/mL時，D101 樹脂吸附率隨多酚濃度的增大而升高，0.8 mg/mL 對應(yīng)吸附率最大，為83.00%，這與低濃度有利于吸附原則相符[27]；當(dāng)上樣濃度高于0.8 mg/mL 時，吸附率下降。上樣濃度過大會縮短大孔樹脂的使用周期，增加其再生次數(shù)，從而影響其使用壽命，因此上樣濃度優(yōu)選0.8 mg/mL。

2.3.3.3 洗脫流速對D101 樹脂解吸效果的影響

洗脫流速對D101 大孔樹脂解吸效果的影響見圖13。

圖13 洗脫流速對D101 大孔樹脂解吸效果的影響Fig.13 Effect of flow rate of eluent on desorption of D101 macroporous resin

由圖13 可知，加快洗脫流速，D101 樹脂對松毛菇多酚的解吸率逐漸下降。由于洗脫流速過快，洗脫液與多酚接觸時間太短，解吸不充分[28]。洗脫速度為1 mL/min 時解吸率最高，當(dāng)流速低于1 mL/min，洗脫效率過低，因此洗脫流速優(yōu)選1 mL/min。

2.3.3.4 洗脫劑用量對D101 大孔樹脂解吸效果的影響

D101 大孔樹脂的動態(tài)洗脫曲線見圖14。

由圖14 可知，松毛菇多酚濃度隨洗脫劑用量增加呈先上升趨勢，當(dāng)洗脫量為1.2 BV 時，松毛菇多酚濃度達(dá)到峰值，隨后下降，在4 BV～4.4 BV 時降至最低后又緩慢回升。現(xiàn)象觀察發(fā)現(xiàn)，采用4 BV 洗脫量洗脫后，洗脫液的顏色由透明淡黃色逐漸變深，因此推斷此時洗脫液中雜質(zhì)增多，可能存在色素影響。為保證多酚純度和節(jié)約成本，50%乙醇的洗脫量優(yōu)選4 BV。

圖14 D101 大孔樹脂的動態(tài)洗脫曲線Fig.14 Dynamic elution curve of D101 macroporous resin

2.3.4 純化前后松毛菇多酚的純度比較

參照1.3.10 的方法，得出粗提及純化后的松毛菇多酚含量分別為（14.60±0.4）、（71.18±0.9）mg/g，純化后多酚含量提高了近3.9 倍，說明經(jīng)D101 大孔樹脂的純化效果良好。

3 結(jié)論

基于單因素試驗，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化松毛菇多酚提取的最佳工藝，建立了該工藝的二次多項回歸模型，模型呈極顯著，與試驗值擬合良好。各因素對松毛菇多酚提取量的影響主次順序為：液料比＞乙醇濃度＞提取溫度。根據(jù)實際可操作條件，優(yōu)化后的最佳提取工藝為：液料比 22 ∶1（mL/g）、提取溫度 67 ℃、乙醇濃度71%，此條件下獲得的松毛菇多酚提取量為14.60 mg/g，與理論預(yù)測值[14.62（mg/g）]的相對誤差僅約0.14%，說明模型具有實際指導(dǎo)意義。

在研究選定樹脂中，篩選D101 為純化松毛菇多酚的最適樹脂，確定其最佳純化工藝為：上樣液pH 3，洗脫劑乙醇濃度50%，上樣流速0.5 mL/min，上樣濃度0.8 mg/mL，洗脫流速1 mL/min，洗脫劑用量4 BV。純化后多酚含量為（71.18±0.9）mg/g，相較于粗提多酚提高了近3.9 倍，表明純化效果良好。