具有增強免疫作用的鐵皮石斛靈芝酒的研制

吳月國，趙錚蓉，吳蓓麗，張萍，梁世寶，劉驊，*

（1.浙江省醫學科學院，浙江杭州310013；2.溫州市中心醫院，浙江溫州325000）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是傳統名貴中藥材，具有降糖、降脂、抗炎、護肝等作用[1-4]。靈芝為多孔菌科真菌赤芝（Ganoderma Lucidum Karst.）或紫芝（Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang）的干燥子實體，亦是傳統名貴中藥材，具有補氣安神、止咳平喘、抗癌、降壓等功效[5-7]。保健酒是將中藥與酒“溶”于一體的藥酒，不僅配制方便、藥性穩定、安全有效，而且因為酒精是一種良好的半極性有機溶劑，藥借酒力、酒助藥勢而充分發揮其效力，提高療效。鐵皮石斛靈芝酒是以鐵皮石斛與靈芝為主要原料，依據中醫養生理論組方，經配方、工藝篩選后精制而成的保健酒。本研究采用提取、浸泡、配制等工藝制備鐵皮石斛靈芝酒，考察其對小鼠的免疫調節作用，以期進一步的開發利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛：浙江民康天然植物制品有限公司；靈芝、黃精、枸杞：華東醫藥股份有限公司藥材參茸分公司；白酒：建德市嚴東關酒廠；ICR 小鼠：浙江省實驗動物中心。

無水葡萄糖：中國食品藥品檢定研究院；苯酚：國藥集團化學試劑有限公司；濃硫酸：西隴化工股份有限公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；印度墨汁：南京都萊生物技術有限公司；刀豆蛋白ConA：美國sigma 公司；噻唑藍、乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司；0.22 μm孔徑濾膜：密理博中國有限公司；RPMI1640 培養基：美國gibco 公司；YAC-1 細胞：中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所；紅細胞裂解液：浙江省醫學科學院藥物研究所自配（配方：NH4Cl 0.3735 g，Tris 0.13 g，溶于 50 mL 雙蒸水，0.22 μm 過濾除菌后使用）。

1.2 儀器

T6 新世紀分光光度計：北京普析通用儀器責任有限公司；AG285 型電子天平、XS205 型電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；DM5500BLED 型熒光顯微鏡：德國萊卡公司；THERMO 3111 培養箱：美國賽默飛世爾科技公司；BIORAD 680 酶標儀：美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 鐵皮石斛靈芝酒制備和含量測定

鐵皮石斛靈芝酒是以鐵皮石斛、靈芝為主要原料，復配黃精和枸杞子，經提取、浸泡、配制等主要工序精制而成[8-9]，人體推薦劑量為每人每日100 mL。苯酚-濃硫酸法測定粗多糖含量[10]。

1.3.2 鐵皮石斛靈芝酒免疫活性測定

1.3.2.1 小鼠分組與給藥

ICR 小鼠，清潔級，雄性，體重 17 g～21 g，由浙江省實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（浙）2016-0010。實驗動物飼料由協同醫藥生物工程公司提供，執行標準GB 14924.3《2010 實驗動物配合飼料營養成分》。飲用水為滅菌城市飲用水，符合GB 5749-2006《生活飲用水衛生標準》的規定。挑選健康ICR 小鼠，按照運動能力，體重狀況分成4 組：陰性對照組、鐵皮石斛靈芝酒低、中、高劑量組，每組10 只。實驗前先將鐵皮石斛靈芝酒濃縮20 倍，然后按人體推薦量的5、10、30 倍劑量配置成低劑量、中劑量、高劑量（8.33、16.67、50.00 mL/kg）的酒精度為 15°的供試品；陰性對照組為15°白酒。供試品灌胃體積為20 mL/kg，每天一次，連續30 d[11-13]。

1.3.2.2 免疫器官重量與臟器系數測定

灌胃給藥30 d，小鼠斷頸處死，75%酒精消毒，無菌解剖，取胸腺，脾臟，肝臟，除去殘留在臟器上的血液，秤重。最后用所得數據計算臟器指數。臟器指數（g/10 g）=器官質量/體質量。

1.3.2.3 二硝基氯苯誘導的小鼠耳腫脹實驗

第24 天灌胃給藥后1 h，將1%二硝基氯苯丙酮橄欖油（丙酮：橄欖油體積比1 ∶1）涂抹在小鼠腹部，涂抹劑量為每只100 uL。給藥第25 天，重復以上步驟。給藥第29 天，各組小鼠右耳前后面均勻涂抹1%二硝基氯苯丙酮橄欖油，涂抹劑量為每只100 μL。各組小鼠左耳以同等方式涂抹橄欖油混合液作為對照。1 d 后，處死小鼠，剪下兩邊耳殼。剪取部位應在同一部位。取下耳片形狀均為橢圓形。小鼠遲發型變態反應由左右耳重量差表示。

1.3.2.4 碳粒廓清實驗

灌胃給藥30 d，將印度墨汁用生理鹽水稀釋5 倍。注射入小鼠體內小鼠軀干發黑（0.1 mL/10 g）。在注射后 2、10 min 從眼眶靜脈叢取血 20 μL，加入到 2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，600 nm 波長測定OD 值，并將小鼠處死，取肝臟、脾臟，稱重。整理得吞噬指數。

1.3.2.5 脾淋巴細胞體外增殖作用實驗

取1.3.2.2 所得小鼠脾臟，裝于含磷酸緩沖鹽溶液的培養皿中，以5 mL 注射塞碾磨，混勻，200 目滅菌雙層尼龍篩過濾。合并濾液，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，彈勻后加少量破紅裂解液，以磷酸緩沖鹽溶液中和破紅，1 500 r/min 再次離心5 min，棄上清，以含10%胎牛血清的RPMI1640 培養液輕輕吹打重懸沉淀。調整小鼠脾細胞為 1.5×109個/mL，100 μL/孔種板于 96孔中。設對照組，鐵皮石斛靈芝酒低、中、高劑量組；各組又分單獨處理組和聯合ConA（5 μg/mL）組；每孔加入供試品100 uL，于37 ℃，5%CO2培養箱中培養44 h后，每孔加入噻唑藍（5 mg/mL）20 μL 繼續培養 4 h。以移液槍小心吸去上清，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，37 ℃孵育20 min，490 nm 測定OD 值。計算增殖指數：增殖指數=（OD樣品-OD空白）/（OD對照-OD空白）

1.3.2.6 小鼠NK 細胞的活性測定

靶細胞的傳代（YAC-1 細胞）：實驗前24 h 將靶細胞進行傳代培養。應用前以磷酸緩沖鹽溶液洗3 次，用RPMI1640 完全培養液調整細胞濃度為4×105個/mL。

小鼠脾細胞懸液的制備（效應細胞）：方法同1.3.2.5。

NK 細胞活性檢測：取靶細胞和效應細胞各50 μL（效靶比 50 ∶1），加入 U 型 96 孔培養板中；靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養液各50 μL，靶細胞最大釋放孔加靶細胞和2.5%聚乙二醇辛基苯基醚各50 μL。

設對照組，鐵皮石斛靈芝酒低、中、高劑量組；各組又分單獨處理組和聯合ConA 組；每孔加入供試品100 μL，于 37 ℃、5%CO2培養箱中培養 24 h，然后將96 孔培養板以1 500 r/min 離心5 min，每孔吸取上清120 μL 置平底96 孔培養板中，同時加入乳酸脫氫酶檢測工作液 60 μL，混勻，室溫（約 25 ℃）避光孵育30 min（用鋁箔包裹后置于水平搖床上緩慢搖動）。然后在490 nm 處測定吸光度。計算NK 細胞活性：

NK 細胞活性/%=（反應孔OD-自然釋放孔OD）/（最大釋放孔OD-自然釋放孔OD）

1.4 數據分析

各組數據用表示，采用SPSS 17.0 統計軟件進行分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛靈芝酒含量測定

粗多糖含量測定標準曲線為：y=0.056 0x-0.006 4，r=0.999 8，每100 mL 鐵皮石斛靈芝酒中粗多糖（以無水葡萄糖計）含量約為160 mg。

2.2 免疫器官重量及臟器系數測定結果

免疫器官重量及臟器系數測定結果見表1。

表1 小鼠臟器指數表（）Table 1 Effect of the spleen and thymus index on mice（）

表1 小鼠臟器指數表（）Table 1 Effect of the spleen and thymus index on mice（）

注：與陰性對照組比較，**表示差異極顯著，P＜0.01。

肝臟/體重比值/（g/10 g）陰性對照組 0 0.044±0.004 0.015±0.002 0.556±0.026低劑量組 8.33 0.048±0.004 0.048±0.004** 0.539±0.037中劑量組 16.67 0.046±0.005 0.046±0.005** 0.520±0.016**高劑量組 50.00 0.045±0.003 0.014±0.002 0.533±0.028組別 劑量/（mL/kg）脾臟/體重比值/（g/10 g）胸腺/體重比值/（g/10 g）

與陰性對照組比較，鐵皮石斛靈芝酒各劑量組小鼠脾臟/體重比值均無統計學意義（P＞0.05）；低、中劑量組的胸腺/體重比值有顯著差異（P＜0.01）；鐵皮石斛靈芝酒各劑量組小鼠肝臟/體重比值均明顯下降，其中中劑量組有顯著差異（P＜0.01）。

2.3 二硝基氯苯誘導的小鼠耳腫脹實驗結果

小鼠耳腫脹實驗結果見表2。

與陰性對照組比較，在引發超敏反應后，鐵皮石斛靈芝酒高劑量組小鼠右耳腫脹明顯。中、低劑量組腫脹度有下降趨勢，尤其中劑量組腫脹度下降趨勢明顯，但也不具統計學意義（P＞0.05）。

表2 小鼠耳腫脹實驗結果（）Table 2 Effect of the ear swelling experiment on mice（）

表2 小鼠耳腫脹實驗結果（）Table 2 Effect of the ear swelling experiment on mice（）

組別劑量/（mL/kg）腫脹度/mg陰性對照組 0 3.83±2.83低劑量組 8.33 3.60±1.80中劑量組 16.67 1.99±1.24高劑量組 50.00 5.09±2.66

2.4 碳粒廓清實驗結果

碳粒廓清實驗結果見表3。

表3 碳粒廓清實驗結果（）Table 3 Effect of the carbon clearance index（）

表3 碳粒廓清實驗結果（）Table 3 Effect of the carbon clearance index（）

注：與陰性對照組比較，*表示差異顯著，P＜0.05。

組別劑量/（mL/kg）吞噬指數陰性對照組 0 3.78±1.181低劑量組 8.33 4.46±0.80中劑量組 16.67 4.81±0.56*高劑量組 50.00 4.34±1.16

與陰性對照組相比，鐵皮石斛靈芝酒各劑量組小鼠的吞噬指數均增加，中劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）。表明鐵皮石斛靈芝酒能提高小鼠碳廓清能力，單核-巨噬細胞功能實驗結果陽性。

2.5 脾淋巴細胞體外增殖作用的影響試驗結果

脾淋巴細胞增殖能力的測定結果見表4。

表4 脾淋巴細胞增殖能力的測定結果（）Table 4 Effect of the transformation level of lymphoid on mice（）

表4 脾淋巴細胞增殖能力的測定結果（）Table 4 Effect of the transformation level of lymphoid on mice（）

注：各給藥組與正常細胞組比較，**表示差異極顯著，P＜0.01。ConA處理組與正常細胞組比較，#表示差異顯著，P＜0.05，##表示差異極顯著，P＜0.01。

增殖指數（聯合ConA 處理）陰性對照組 0 1±0.03 2.17±0.42#低劑量組 8.33 1.12±0.21 1.17±0.12中劑量組 16.67 7.4±0.15** 5.37±1.78高劑量組 50.00 10.39±0.64** 11.77±0.17##組別劑量/（mL/kg） 增殖指數（單獨處理）

如表4 所示，單獨給藥時，鐵皮石斛靈芝酒具有明顯的促淋巴細胞增殖作用，并且這一作用呈濃度依賴性增加。ConA 聯合處理組對小鼠淋巴細胞增殖有一定的促進作用，高劑量組與對照組相比有顯著性差異。聯合給藥時，鐵皮石斛靈芝酒各劑量組刺激脾淋巴細胞增殖程度均較單獨給藥時沒有顯著性差異，提示其與ConA 沒有協同促進作用。

2.6 NK細胞活性測定結果

NK 細胞活性測定結果見表5。

表5 NK 細胞活性測定結果（）Table 5 Effect of the activity of natural-killer cells（NK）on mice（）

表5 NK 細胞活性測定結果（）Table 5 Effect of the activity of natural-killer cells（NK）on mice（）

注：聯合ConA 處理組與正常細胞組比較，*表示差異顯著，P＜0.05。

NK 細胞活性/%（聯合ConA 處理）陰性對照組 0 -6.48±6.24 -25.50±18.85低劑量組 8.33 13.06±28.89 64.37±19.64*中劑量組 16.67 -3.55±6.30 -3.13±0.73高劑量組 50.00 -4.08±2.02 -5.02±1.27組別劑量/（mL/kg） NK 細胞活性/%（單獨處理）

在對NK 細胞活性測定試驗中，與陰性對照組相比，鐵皮石斛靈芝酒單獨處理組及聯合給藥高、中劑量組對小鼠NK 細胞活性無顯著影響，鐵皮石斛靈芝酒單獨處理及聯合給藥低劑量組有增加NK 細胞活性趨勢，且聯合給藥低劑量組與對照組存在顯著性差異。

3 結論

依據傳統中醫養生理論配伍的鐵皮石斛靈芝酒中，主料鐵皮石斛滋陰補虛，益脾肺腎，護肝膽，填五臟內虛不足；配伍靈芝，滋肝健脾，養血安神；黃精，枸杞子，滋腎陰補脾氣益精血，以助滋陰培本之力；白酒辛溫走散，引藥入血；諸品合用共奏滋陰精益肝脾，以達培本清源之功。本研究中，將鐵皮石斛、靈芝、黃精、枸杞子添加到白酒浸提，制成鐵皮石斛靈芝酒，采用現代藥效學的研究方法，評價其對小鼠的免疫調節活性，結果顯示鐵皮石斛靈芝酒能提高小鼠胸腺指數，降低小鼠耳腫脹度，促進淋巴細胞增殖，增加小鼠吞噬指數和NK 細胞活性。表明鐵皮石斛靈芝酒各組分組成的一個整體，產生了協同作用，具有增強免疫力的保健功能，可用于開發增強免疫力作用的保健食品或藥物。