響應(yīng)面優(yōu)化金銀花綠原酸提取工藝及抗氧化作用研究

石艷賓，李文靜

（1.天津天獅學(xué)院，天津301700；2.天津嘉匯捷瑞醫(yī)藥科技有限公司，天津301800）

金銀花（Lonicera japonica）是忍冬初開(kāi)的花或干燥的花蕾，具有抗病原微生物、抗炎、解熱、保肝、降血脂、止血、免疫調(diào)節(jié)等作用，臨床主要用于治療各種感染、炎癥、高血脂、腫瘤放療等[1-2]。綠原酸是金銀花中典型的抗氧化功效成分，有很強(qiáng)的藥理活性，對(duì)血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)疾病均有顯著療效[3-4]。蘆丁是典型黃酮類抗氧化物質(zhì)，能降低炎癥，有抗病毒和抗氧化作用，可用于防治腦溢血、高血壓、視網(wǎng)膜出血、紫癜和急性出血性腎炎等疾病[5-6]。劉亞敏等利用正交試驗(yàn)優(yōu)選山銀花綠原酸提取工藝條件，指出山銀花綠原酸提取物具有較好的自由基清除能力[7]。Tingting Cui 等[8]應(yīng)用Box-Behnken 分析萃取溫度、乙醇濃度、浸泡時(shí)間對(duì)金銀花綠原酸提取率的影響，優(yōu)化綠原酸提取條件為提取溫度80 ℃、乙醇濃度為70.37%、浸泡時(shí)間為9.35 h。蔣美麗等分析超聲輔助乙醇提取金銀花綠原酸，提出料液比、時(shí)間對(duì)綠原酸提取率有顯著性影響[9]。研究表明[10-12]，黃酮類物質(zhì)間、多酚類物質(zhì)間、番茄紅素與甘草黃酮、VE間存在一定程度的協(xié)同抗氧化作用，但對(duì)酚類物質(zhì)與黃酮類物質(zhì)間的抗氧化協(xié)同作用研究的較少。本文利用響應(yīng)面軟件優(yōu)化金銀花綠原酸超聲波輔助法提取工藝條件，評(píng)價(jià)金銀花綠原酸提取物的抗氧化性，分析酚型抗氧化物質(zhì)綠原酸與黃酮類抗氧化物質(zhì)蘆丁間的協(xié)同抗氧化作用，符合復(fù)配抗氧化劑的發(fā)展趨勢(shì)，為天然產(chǎn)物的深度開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）：sigma 公司；維生素 C、無(wú)水乙醇：分析純，天津江天化工技術(shù)有限公司；金銀花（水分含量7 %）：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204 分析天平：梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；UV1000 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海天美科學(xué)儀器有限公司；KM-5200DE 超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；TD5K-Ⅲ低速離心機(jī)：長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；XL-60C 賽多利高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：上海恒科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 金銀花綠原酸的提取工藝

準(zhǔn)確稱取粉碎處理金銀花樣品2 g 于250 mL 磨口三角瓶中，加入乙醇溶液進(jìn)行超聲輔助提取。金銀花綠原酸提取液離心機(jī)轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心處理20 min，傾出上清液用蒸餾水定容至100 mL 容量瓶，搖勻待測(cè)。

1.3.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

吸取一定量濃度為117 μg/mL 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL 容量瓶中，配制成濃度依次為 0、4.68、9.36、14.04、18.72、23.40、28.08 μg/mL 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)溶液，以零管為空白，在波長(zhǎng)328 nm 處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值。以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，制作綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.048 0x-0.005 0 和相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9，金銀花樣品中綠原酸按照下面公式計(jì)算。

綠原酸提取率/%=（提取液的濃度×稀釋倍數(shù)×100/樣品質(zhì)量）×100

1.3.3 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的金銀花粉2 g，置于250 mL磨口三角瓶中，在其他條件相同的情況下，采用不同乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時(shí)間進(jìn)行金銀花綠原酸超聲輔助提取。以金銀花綠原酸提取率為考核指標(biāo)，比較各因素的條件變化對(duì)綠原酸提取率的影響，確定各因素的優(yōu)水平。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化金銀花綠原酸的提取工藝

基于金銀花綠原酸單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時(shí)間為影響因素，以綠原酸提取率為考核指標(biāo)，應(yīng)用SAS9.3 軟件設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)如表1 所示。

表1 綠原酸響應(yīng)面法提取試驗(yàn)的因素與水平Table 1 Factors and levels in Box-Benhnken design of chlorogenic acid

1.3.5 金銀花綠原酸、蘆丁抗氧化能力的測(cè)定

1.3.5.1 金銀花綠原酸、蘆丁抗氧化能力測(cè)定

準(zhǔn)確稱取23.6 mg DPPH 試劑，用70%甲醇溶液配制成6×10-4（mol/L）DPPH 溶液，作為母液于冰箱冷藏備用。使用時(shí)從母液中吸取10 mL，用70%甲醇溶液定容至100 mL 的容量瓶中，作為DPPH 自由基測(cè)定的反應(yīng)試劑[12-13]。將綠原酸提取物、蘆丁、VC配制成適宜濃度的待測(cè)系列樣品溶液，測(cè)定DPPH 自由基清除率，并以VC對(duì)DPPH 自由基清除效果為對(duì)照，評(píng)價(jià)金銀花綠原酸提取物、蘆丁的抗氧化活性。分別移取0.6 mL綠原酸提取物、蘆丁、VC待測(cè)樣品溶液于棕色比色管中，加入6×10-5（mol/L）DPPH 甲醇溶液6 mL，混合搖勻、靜置反應(yīng)30 min 后，在517 nm 處測(cè)定反應(yīng)后的吸光度Ar。70%甲醇溶液與DPPH 溶液反應(yīng)的吸光度為空白對(duì)照Ac，綠原酸提取物、蘆丁、VC樣品溶液與甲醇溶液對(duì)應(yīng)的吸光度為A0，DPPH 自由基清除率計(jì)算公式如下：

1.3.5.2 金銀花綠原酸、蘆丁協(xié)同抗氧化能力測(cè)定

在金銀花綠原酸、蘆丁抗氧化能力分析的基礎(chǔ)上，將金銀花綠原酸提取物與蘆丁按1 ∶1、1 ∶3、3 ∶1、1 ∶9、9 ∶1 體積比進(jìn)行混合，依據(jù)上述試驗(yàn)方法方依次測(cè)定A0、Ar、Ac值，計(jì)算復(fù)配溶液抗氧化協(xié)同系數(shù)（SE），分析金銀花綠原酸與蘆丁協(xié)同清除DPPH 自由基的效果。抗氧化協(xié)同系數(shù)SE 為復(fù)合溶液測(cè)定的清除率（ESC）和理論清除率（TSC）之間的比值。當(dāng)SE＜1，綠原酸提取物與蘆丁間沒(méi)有明顯的協(xié)同作用；SE＞1，表示二者間具有協(xié)同作用。理論清除能力（TSC）的計(jì)算如下：

式中：ESC1為復(fù)合溶液中綠原酸的試驗(yàn)測(cè)定清除率，%；ESC2為復(fù)合溶液中蘆丁試驗(yàn)清除率，%。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法

單因素試驗(yàn)平行3 次，采用EXCEL 進(jìn)行單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用SAS.9.3 軟件進(jìn)行優(yōu)化提取工藝條件及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花綠原酸提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)綠原酸提取率的影響

在料液比 1 ∶20（g/mL）、超聲溫度 30 ℃、超聲時(shí)間20 min 的條件下，考察不同提取溶劑乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）對(duì)金銀花綠原酸提取效果的影響，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 乙醇濃度對(duì)金銀花綠原酸提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of Lonicera japonica chlorogenic acid

由圖1 可知，金銀花綠原酸的提取率隨著乙醇濃度的升高逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)金銀花綠原酸提取率最高。繼續(xù)增大乙醇溶液濃度，可能是由于一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，競(jìng)爭(zhēng)與乙醇、水分子結(jié)合，導(dǎo)致綠原酸提取率出現(xiàn)下降現(xiàn)象，故確定金銀花綠原酸提取溶劑乙醇濃度為70%。

2.1.2 料液比對(duì)綠原酸提取率的影響

在超聲溫度30 ℃、超聲時(shí)間20 min、乙醇濃度70 %的條件下，考察料液比 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）對(duì)金銀花綠原酸提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)金銀花綠原酸提取率的影響Fig.2 Effect of solid/liquid ratio on the yield of Lonicera japonica chlorogeni cacid

綠原酸提取率隨溶劑體積的增加而增大，當(dāng)料液比增加至1 ∶20（g/mL）后金銀花中綠原酸的提取率達(dá)到最大值，隨后變化基本趨于不變。提取溶劑量越大，提取效果越好，但過(guò)多的提取溶劑使有些難溶出的物質(zhì)有可能被提取出來(lái)，對(duì)綠原酸的提取造成干擾，也會(huì)對(duì)后處理工序造成麻煩及能源浪費(fèi)。因此，確定料液比 1 ∶20（g/mL）較為適宜。

2.1.3 超聲溫度對(duì)綠原酸提取率的影響

在超聲時(shí)間 20 min、料液比 1 ∶20（g/mL）、乙醇濃度 70%的條件下，考察超聲溫度（30、40、50、60、70 ℃）對(duì)金銀花綠原酸提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 超聲溫度對(duì)金銀花綠原酸提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the yield of Lonicera japonica chlorogenic acid

金銀花綠原酸提取率在30 ℃至40 ℃時(shí)，隨溫度升高而上升；在40 ℃至70 ℃之間，隨著溫度的升高綠原酸提取率反而出現(xiàn)下降趨勢(shì)。提取溫度的升高可增大綠原酸的溶出量，但溫度過(guò)高可能導(dǎo)致綠原酸的結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致提取率降低。因此，金銀花綠原酸提取的較適宜溫度為40 ℃。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響

在乙醇濃度 70%、料液比 1 ∶20（g/mL）、超聲溫度40 ℃的條件下，考察超聲時(shí)間（10、20、30、40、50 min）對(duì)金銀花綠原酸提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)金銀花綠原酸提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield of Lonicera japonica chlorogenic acid

由圖4 可知，金銀花綠原酸提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象，超聲提取20 min 時(shí)綠原酸提取率最高。綠原酸提取率在提取時(shí)間大于20 min 后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能提取時(shí)間延長(zhǎng)使部分綠原酸結(jié)構(gòu)破壞，從而導(dǎo)致綠原酸提取率降低。因此，選擇20 min為金銀花綠原酸的較適宜提取時(shí)間。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化金銀花綠原酸提取條件

2.2.1 金銀花綠原酸響應(yīng)面提取試驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)金銀花綠原酸提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用SAS9.3 軟件實(shí)施四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，分析乙醇濃度、料液比、溫度、時(shí)間對(duì)金銀花綠原酸提取率的影響，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Results of Box-Benhnken design

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Continue table 2 Results of Box-Benhnken design

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析

根據(jù)表2 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行金銀花綠原酸提取的響應(yīng)面方差分析，詳見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Benhnken design

由表3 可知，C、D、BC 對(duì)綠原酸提取的影響顯著，B、A2、B2、C2、CD、D2對(duì)提取的影響非常顯著。由 F 值的大小可以推斷出，這4 個(gè)因素在所規(guī)定的范圍內(nèi)對(duì)金銀花綠原酸提取的影響程度依次為B（料液比）＞C（超聲溫度）＞D（超聲時(shí)間）＞A（乙醇濃度）。

應(yīng)用SAS9.3 軟件進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，對(duì)乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度4 個(gè)因素進(jìn)行回歸擬合，得到多元響應(yīng)面回歸模型：Y=-15.312 2+0.360 5A+0.415 167B + 0.207 167C - 0.066 25D - 0.001 237A2-0.000 45AB-0.001 125AC+0.000 375AD-0.007 3B2+0.002 9BC + 0.000 25BD - 0.001 662C2+ 0.001 85CD -0.001 175D2。回歸模型P=0.000 2＜0.01，失擬項(xiàng)P=0.205 8＞0.05，說(shuō)明回歸方程顯著、失擬項(xiàng)不顯著，響應(yīng)面回歸方程的擬合程度良好。

2.2.3 響應(yīng)面圖分析

應(yīng)用SAS9.3 對(duì)表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，繪制出響應(yīng)曲面圖5～圖10。

圖5 乙醇濃度與料液比對(duì)綠原酸提取的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration and liquid ratio on the yield of chlorogenic acid

圖6 乙醇濃度與超聲溫度對(duì)綠原酸提取的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration and ultrasonic temperature on the yield of chlorogenic acid

圖7 乙醇濃度與超聲時(shí)間對(duì)綠原酸提取的影響Fig.7 Effect of ethanol concentration and ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid

圖8 料液比與超聲溫度對(duì)綠原酸提取的影響Fig.8 Effect of liquid ratio and ultrasonic temperature on the yield of chlorogenic acid

圖9 料液比與超聲時(shí)間對(duì)綠原酸提取的影響Fig.9 Effect of liquid ratio and ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid

根據(jù)響應(yīng)面回歸方程及響應(yīng)曲面圖，因素BC、CD的交互作用明顯。采用軟件優(yōu)化分析得出最佳提取條件為乙醇濃度 68.9%、料液比 1 ∶22.8（g/mL）、超聲溫度43.6 ℃、超聲時(shí)間19.8 min。為了便于控制金銀花綠原酸提取條件，提取參數(shù)設(shè)置為乙醇濃度69%、料液比 1 ∶23（g/mL）、超聲溫度 44 ℃、超聲時(shí)間 20 min，進(jìn)行綠原酸提取的3 次平行驗(yàn)證試驗(yàn)。依據(jù)試驗(yàn)方法1.2.1 和1.2.2 金銀花綠原酸提取率平均值為6.20%，均高于響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，故確定此方案為優(yōu)化方案。

圖10 超聲溫度與超聲時(shí)間對(duì)綠原酸提取的影響Fig.10 Effect of ultrasonic temperature and ultrasonictime on the yield of chlorogenic acid

2.3 金銀花綠原酸抗氧化能力分析

2.3.1 金銀花綠原酸提取物的抗氧化能力評(píng)價(jià)

測(cè)定VC溶液、金銀花綠原酸提取液、蘆丁溶液系列濃度下DPPH 自由基清除率繪制濃度-清除率，見(jiàn)圖11，計(jì)算抗氧化樣品溶液的半數(shù)清除率IC50值、回歸方程，詳見(jiàn)表4。

圖11 VC、綠原酸和蘆丁對(duì)DPPH 自由基的清除作用Fig.11 Scavenging effect on DPPH free radical of VC，chlorogenic acid and rutin

表4 VC、綠原酸和蘆丁回歸方程與IC50 值Table 4 Regression equation and IC50 on antioxidants of VC，chlorogenic acid and rutin

由圖11、表4 可知，金銀花綠原酸、VC、蘆丁都具有較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力，且清除能力隨著抗氧化樣品溶液濃度的增大而增強(qiáng)。通過(guò)比較三者的半數(shù)清除率IC50值可知，金銀花綠原酸抗氧化能力略強(qiáng)于VC，蘆丁相比綠原酸、VC，抗氧化能力較差。

2.3.2 蘆丁與綠原酸的協(xié)同作用

依據(jù)試驗(yàn)方法1.3.5，將濃度為30 μg/mL 金銀花綠原酸和蘆丁樣品溶液，按照復(fù)配體積比為1 ∶1、1 ∶3、3 ∶1、1 ∶9、9 ∶1 進(jìn)行混合，測(cè)定金銀花綠原酸提取液與蘆丁溶液的混合液DPPH 自由基清除率，分析二者間協(xié)同抗氧化效果，結(jié)果見(jiàn)圖12。

圖12 綠原酸與蘆丁的協(xié)同抗氧化作用Fig.12 Synergistic antioxidant effect of chlorogenic acid and rutin

通過(guò)計(jì)算協(xié)同系數(shù)SE，分析5 種不同混合溶液抗氧化效果，金銀花綠原酸與蘆丁配比為9 ∶1 時(shí)SE 為1.05，均高于其他4 種混合溶液，協(xié)同增效作用明顯。

3 結(jié)論

應(yīng)用SAS9.3 軟件建立金銀花綠原酸提取的多項(xiàng)回歸方程模型，方程擬合良好。在確定的4 個(gè)因素水平范圍內(nèi)，對(duì)金銀花綠原酸提取的影響程度依次為B＞C＞D＞A，因素 BC、CD 交互作用明顯。采用軟件優(yōu)化分析得出最佳提取條件為乙醇濃度69 %、料液比1 ∶23（g/mL）、超聲溫度 44 ℃、超聲時(shí)間 20 min，驗(yàn)證結(jié)果為6.20%，與理論預(yù)測(cè)值接近，表明多項(xiàng)回歸模型能較好的對(duì)金銀花綠原酸的輔助提取進(jìn)行預(yù)測(cè)。金銀花綠原酸DPPH 自由基的半數(shù)清除率為21.09 μg/mL，具有明顯的抗氧化活性。金銀花綠原酸與蘆丁具有一定的協(xié)同作用，復(fù)配比例9 ∶1 時(shí)SE 值為1.05，兩者間協(xié)同增效作用明顯。