益氣活血通脈顆粒對腦缺血再灌注模型大鼠顳葉神經元損傷的影響

姜瑾， 任平， 劉悅， 許杰， 崔娜， 王璐， 李國信

（1.遼寧中醫藥大學附屬第二醫院，遼寧省中醫藥研究院，遼寧沈陽 110034；2.沈陽明華制藥有限公司，遼寧沈陽 110135）

大腦中動脈閉塞腦梗死是臨床常見的腦血管病，臨床表現為偏身感覺障礙、對側偏癱、完全性失語等，可因腦水腫、顱內高壓而發生腦主干閉塞、皮層性對稱側偏癱，頭面部與上肢重于下肢。在大腦中動脈梗死急性期過后，患者往往遺留嚴重的神經功能缺損癥狀[1-3]。中醫藥治療腦血管病方面有一定的積累和優勢。益氣活血通脈顆粒是本院腦病科劉悅教授治療腦梗死的經驗方，以清·王清任《醫林改錯》中補陽還五湯為主化裁而成，主要成分為黃芪、當歸、白芍、川芎、桃仁、紅花、地龍、全蝎等，具有益氣活血、化瘀通絡、舒頸醒腦的作用，在臨床應用多年，療效顯著。為進一步探討其作用機制，本研究以腦缺血再灌注模型大鼠為研究對象，對該方劑進行了與功能主治有關的藥效學實驗，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物SPF級健康雌性SD大鼠166只，體質量220～260 g，購于遼寧長生生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（遼）2015-0001。飼養于遼寧省中醫藥研究院實驗動物中心，室內溫度22～25℃，濕度55%～60%，動物使用許可證號：SYXK（遼）2012-0010。本項目的實施已通過遼寧省中醫藥研究院實驗動物倫理委員會有關動物倫理及動物福利的審查。

1.2藥物益氣活血通脈顆粒，規格：5 g/袋，每袋相當于12 g生藥，由遼寧中醫藥大學附屬第二醫院中藥藥劑實驗室提供，批號：20151124。用法用量：口服，每次5 g，每日2次。銀杏葉片（規格：19.2 mg），由華納大藥廠生產，批號：160217。用法用量：口服，每次1片，每日3次。

1.3試劑大鼠神經生長因子（NGF）免疫組化試劑盒、腦源性神經營養因子（BDNF）免疫組化試劑盒（博士德生物工程有限公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，北京Solarbio科技有限公司，批號：5091034）；多聚甲醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20161203）；無水乙醇（沈陽市新化試劑廠，批號：20160121）；二甲苯（沈陽市新化試劑廠，批號：20151125）；枸櫞酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150713）；磷酸緩沖液（PBS，北京Solarbio科技有限公司，批號：20150815）；水合氯醛（北京市旭東化工廠，批號：20000530）。

1.4儀器BX53型光電顯微鏡（奧林巴斯中國有限公司）；JKDP2型電熱恒溫培養箱（廈門醫療電子儀器廠）；TP1020自動脫水機、Leica切片機（德國Leica公司）；YG-280KX攤片機（湖北孝感市陽光神琦醫用科技有限公司）；YG-280KX烤片機（湖北孝感市陽光神琦醫用科技有限公司）。

1.5分組、造模與給藥166只大鼠按體質量隨機選取16只作為假手術組，其余150只制備腦缺血再灌注模型。采用改良線栓法[4]復制腦缺血再灌注模型：按照3 mL/kg體質量腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉大鼠，將大鼠仰臥位固定到操作臺上，頸部褪毛、消毒，分離并結扎頸外動脈和頸總動脈。將栓線經頸外動脈向頸內動脈插入約（18.0±2.0）mm到達大腦中動脈并阻塞大腦中動脈，缺血120 min后，將栓線抽離，確認無出血后用酒精消毒，涂青霉素粉，縫合皮膚。假手術組將線栓插入頸動脈，但未深入到大腦中動脈。術后再灌注4 h后對造模大鼠進行神經功能損傷評分[5]。根據Bederson的神經行為損傷評分標準[6]進行篩選：1～3分者為成功模型，0分、4分或死亡者剔除。將成功的腦缺血再灌注模型大鼠按照其神經功能損傷評分結果隨機分為模型組，中藥低、中、高劑量組，每組16只。造模結束后，中藥低、中、高劑量組給予益氣活血通脈顆粒（生藥劑量為2.16、4.32、8.64 g·kg-1·d-1，相當于臨床成人擬用等效劑量、2倍等效劑量、4倍等效劑量）灌胃，銀杏葉片組給予銀杏葉片混懸液（劑量為5.18 g·kg-1·d-1，由蒸餾水配制）灌胃，假手術組、模型組給予等體積蒸餾水灌胃。給藥體積為10 mL·kg-1·d-1，連續給藥5 d。末次給藥1 h后，對各組大鼠進行神經功能評價，然后斷頭取腦，計算腦梗死率、檢測顳葉神經元NGF和BDNF的表達。

1.6觀察指標與方法

1.6.1 檢測神經行為學 神經行為損傷評分標準[6]：無神經功能缺損癥狀，計0分；不能完全伸展右側前爪，計1分；自由行走向右側旋轉，計2分；自由活動時向右側傾倒，計3分；意識喪失，不能行走，計4分。0分、4分或死亡者剔除，1～3分者選為實驗對象。

1.6.2 TTC染色[7]觀察腦梗死情況 按神經行為損傷評分每組隨機抽取10只大鼠，斷頭處死，取大腦，-20℃冷凍20 min后，將大腦組織切取2 mm厚度冠狀位腦片，切成5片，放入2%TTC溶液中，37℃溫箱孵育30 min染色，每隔10 min翻動1次。孵育完畢后將腦片置于體積分數10%甲醛中固定2 h后拍照。染色后的腦梗死區呈灰白色。采用Image-J軟件測量腦梗死面積，計算腦梗死率。腦梗死率=腦梗死區面積/全腦面積×100%。

1.6.3 免疫組化法檢測大鼠腦顳葉神經元NGF和BDNF表達 將各組剩余的6只大鼠按照3 mL/kg體質量腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉后，將大鼠仰臥位固定到操作臺上，開胸暴露心臟，灌注針刺入左心室，右心耳剪一小孔，用生理鹽水沖洗至肝臟變白；再用40 g/L多聚甲醛固定液400 mL（由0.01 mol/L PBS配制，pH 7.4）灌流固定，直至身體逐漸僵硬震顫為止[8]。斷頭、開顱取各組大鼠大腦中動脈供血區域的腦組織行冠狀位切片，置于40 g/L多聚甲酸溶液中固定24 h。固定后的腦組織用酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片備用。檢測時，將大鼠腦組織切片60℃烘烤4 h，二甲苯透明2次，置于無水乙醇中浸泡5 min、體積分數90%乙醇浸泡4 min、體積分數80%乙醇浸泡3 min、體積分數70%乙醇浸泡2 min，蒸餾水浸泡1 min。滴加體積分數3%H2O2去離子水孵育20 min。PBS緩沖液漂洗5 min。于枸櫞酸鈉緩沖液（pH 7.0）中高壓修復5 min。血清封閉30 min后，加入PBS稀釋的一抗（NGF 1∶400、BDNF 1∶550），4℃孵育過夜。PBS緩沖液漂洗5 min。再加入生物素標記的二抗，37℃孵育2 h。PBS緩沖液漂洗5 min。滴加鏈霉親和素—過氧化物酶，37℃孵育30 min。PBS緩沖液漂洗5 min。滴加DAB顯色劑。自來水漂洗。蘇木精復染10 min，自來水漂洗3 s，加入1%鹽酸乙醇分化5 s，自來水漂洗30 s。中性樹膠封片。采用Image J軟件對經免疫組化染色組織進行灰度值分析，計算各組積分光密度（IOD）[9]。

1.7統計方法采用SPSS 22.0統計軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（-x±s）表示。不符合正態分布者采用秩和檢驗，滿足正態性和方差齊性者采用LSD（L）檢驗，滿足正態性但不滿足方差齊性者采用Dunnet’s C（U）檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠神經行為損傷評分比較治療前：與假手術組比較，各組大鼠神經行為損傷評分均顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組神經行為損傷評分未見顯著性差異（P＞0.05）。治療后：與假手術組比較，模型組神經行為損傷評分顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，中藥高劑量組、銀杏葉片組神經行為損傷評分均顯著降低（P＜0.05）。結果見表1。

2.2各組大鼠腦梗死率比較與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死率顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，中藥中、高劑量組及銀杏葉片組大鼠腦梗死率顯著降低（P＜0.05）。結果見表2。

2.3各組大鼠腦顳葉神經元NGF和BDNF表達比較NGF：與假手術組比較，模型組大鼠腦顳葉NGF表達有所增加，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組及銀杏葉片組NGF表達水平顯著增加（P＜0.05）。BDNF：與假手術組比較，模型組BDNF表達水平顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，中藥高劑量組及銀杏葉片組BDNF表達水平顯著增加（P＜0.05）。結果見表3、圖1、圖2。

表2 各組大鼠腦梗死率比較Table 2 Comparison of the cerebral infarction rate in various groups （s，p/%）

表2 各組大鼠腦梗死率比較Table 2 Comparison of the cerebral infarction rate in various groups （s，p/%）

①P＜0.01，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組銀杏葉片組腦梗死率0 19.36±4.13①16.13±4.25 14.76±3.78②13.38±3.21②12.97±4.47②N 10 10 10 10 10 10

表3 各組大鼠腦顳葉神經元NGF和BDNF表達比較Table 3 Comparison of the expression levels of NGF and BDNF in temporallobe neurons of various groups （s，p）

表3 各組大鼠腦顳葉神經元NGF和BDNF表達比較Table 3 Comparison of the expression levels of NGF and BDNF in temporallobe neurons of various groups （s，p）

①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組銀杏葉片組BDNF 0.047±0.011 0.094±0.023①0.105±0.019 0.132±0.024 0.182±0.036②0.249±0.043②N 6 6 6 6 6 6 NGF 0.053±0.009 0.103±0.011 0.155±0.021 0.199±0.043②0.260±0.087②0.281±0.092②

圖1 各組大鼠腦顳葉神經元NGF表達結果（免疫組化法，×200）Figure 1 Comparison of the expression of NGF in temporallobe neurons of various groups（immunohistochemistry，×200）

3 討論

腦梗死是由于腦組織局部供血動脈血流突然減少，造成該血管供血區的腦組織缺血、缺氧進而導致腦組織壞死、軟化，并伴有相應部位臨床癥狀，如失語、偏癱等神經功能缺失癥狀。腦梗死是缺血性腦卒中的總稱，是腦血液供應障礙引起的腦部病變[10]。中樞性癱瘓是錐體束受損產生，因上運動神經元受損，失去了對下運動神經元的調控作用而產生的隨意運動減弱，其主要表現為肌張力增高[11-13]。周圍性癱瘓也稱下運動神經元性癱瘓[14]，是因腦干運動神經核受損害產生的癱瘓。因下運動神經元受損，使其所支配的肌肉得不到足夠的沖動興奮，表現為肌張力下降、反射消失。本研究結果顯示：給藥前，各造模組神經行為損傷評分均比假手術組顯著增加，提示大鼠腦中動脈阻塞缺血再灌注模型復制成功。治療5 d后，模型組神經行為損傷評分較假手術組顯著增加，提示大鼠腦中動脈阻塞缺血再灌注模型尚未完全自然恢復。益氣活血通脈顆粒各劑量組神經行為損傷評分較模型組均有所降低，呈劑量依賴性，說明益氣活血通脈顆粒對大腦中動脈阻塞缺血再灌注模型具有治療作用。

圖2 各組大鼠腦顳葉神經元BDNF表達結果（免疫組化法，×200）Figure 2 Comparison of the expression of BDNF in temporallobe neurons of various groups（immunohistochemistry，×200）

腦是對缺血、缺氧最為敏感的重要器官，腦組織缺血將會引起局部腦組織功能損害，其損害程度與缺血時間長短有關，短期缺血會引起可逆性損害，長時間的缺血會引起梗死，腦梗死所引起的組織學變化表現為腦水腫及腦細胞壞死[15]。益氣活血通脈顆粒主要由補氣活血藥物組成，具有益氣活血、化瘀通絡的功效，其治療腦缺血的機制可能與改善微循環、增加缺血區血液供應有關。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死率顯著增加。與模型組比較，益氣活血通脈顆粒各劑量組腦梗死率顯著降低，且呈劑量依賴性。提示益氣活血通脈顆粒對短時間大腦中動脈阻塞所引起的腦梗死具有治療作用。

NGF廣泛分布于腦組織，可促進中樞和外周神經元的生長、發育、分化，維持神經系統的正常功能，加快神經系統損傷后的修復。當NGF效應神經元受到損傷（如外傷損害、缺血缺氧等）神經元將發生一系列的病理改變（如死亡），NGF可以抑制上述神經損傷，同時能影響受損神經元再生時間和再生速度[16，17]。BDNF分布于中樞神經系統內，海馬和皮質中的含量最高[18，19]，對腦神經元的生長起重要作用。BDNF可以防止神經元受損死亡，并能夠促進受損神經元再生及分化。本研究結果顯示，與模型組比較，益氣活血通脈顆粒各劑量組顳葉神經元NGF和BDNF表達均增加，且呈劑量依賴性。表明益氣活血通脈顆粒可以通過增加顳葉神經元NGF和BDNF表達，進而促進受損神經元的再生及分化，從而起到對大鼠腦中動脈阻塞缺血再灌注損傷的治療作用。

綜上所述，益氣活血通脈顆粒對腦缺血再灌注模型大鼠產生的治療作用可能與增加腦顳葉神經元NGF和BDNF的表達有關。