膚悅康洗劑對豚鼠濕疹皮損的修復機制

張玲， 林素財， 鄭永平

（廣州中醫藥大學附屬中山市中醫院皮膚科，廣東中山 528400）

慢性濕疹是一種炎癥性皮膚病，由多種因素引起，可以持續數月、數年甚至數十年，主要表現為明顯的瘙癢、滲出、水腫，高復發[1]。目前仍缺乏有效的治療方法[2]。傳統治療方法如口服抗組胺藥、免疫抑制劑、外用皮質類固醇等都易使病情反復發作。物理治療如液氮冷凍、二氧化碳激光、使用同位素和釋放淺層X線等的有效性和安全性都難以令人滿意，其應用也因此受到限制。膚悅康洗劑作為中藥制劑，臨床上在治療急性和亞急性濕疹方面具有較好效果[3]，然而膚悅康洗劑在治療濕疹方面的作用機制尚未明確。

自1951年開始將豚鼠模型作為一種可靠的醫學動物模型在皮膚病學中使用[4]。2，4-二硝基氯苯（DNCB）誘導的皮膚刺激模型與濕疹在病因、臨床表現和病理變化等方面有許多相似之處[5]。故本研究選用DNCB誘發制備豚鼠濕疹模型。本課題組既往實驗表明，DNCB誘導的豚鼠濕疹皮膚組織病理檢查見不同程度的表皮細胞變性，真皮有不同程度的血管擴張、充血和水腫以及大量炎癥細胞浸潤，濃度不小于1.2 g/mL的膚悅康洗劑可有效改善該皮損病理改變[6]。為進一步探討膚悅康洗劑對豚鼠濕疹的抗炎作用，本研究以DNCB豚鼠濕疹模型為研究對象，觀察其對豚鼠濕疹皮膚組織細胞因子的影響，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級雌性Hartley豚鼠36只，體質量200～240 g，4～5周齡，由廣東實驗動物中心提供[生產許可證號：SCXK（粵）2016-0041]。實驗于中山市中醫院實驗室[使用許可證號：SYXK（粵）2015-0109]（屏障環境）完成。動物實驗過程中執行3R原則，IACUC編號：20160513024654。

1.2藥物膚悅康洗劑（主要組成：苦參20 g、土槿皮20 g、廣東紫荊皮10 g、蘆薈5 g、石菖蒲5 g、麻黃5 g等）由中山市中醫院制劑室提供；哈西奈德溶液（天津市天驕制藥有限公司，CAS號：H12020342）。

1.3試劑與儀器DNCB（美國Sigma公司，CAS號：528-76-7）；丙酮（國藥集團化學試劑有限公司，CAS：67-64-1）；硫化鈉（國藥集團化學試劑有限公司，CAS號：1313-84-4）；抗干擾素γ（IFN-γ）抗體（美國CST公司）；抗轉化生長因子β1（TGF-β1）抗體（美國Abcam公司）；TRIzol Reagent（美國Invitrogen公司）；逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司）；中強度RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL發光液（杭州弗德生物科技有限公司）；5×蛋白上樣緩沖液（武漢博士德有限公司）；脫脂奶粉（BD）、吐溫-20（上海阿拉丁生化科技有限公司）。ST16高速離心機（美國Thermo Fisher公司）；DG5031多功能酶標儀（華東電子有限公司）；XMTD204水浴鍋（常州智博儀器制造有限公司）；MF113W掃描儀（日本Canon公司）。

1.4分組、造模與給藥將36只豚鼠隨機分為正常組，模型組，哈西奈德組，膚悅康洗劑低、中、高劑量組，每組6只。按照文獻[7]復制豚鼠濕疹模型。給予豚鼠20 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，應用80 g/L硫化鈉溶液在豚鼠背部面積為4 cm×3 cm的區域內進行脫毛，使皮膚暴露。將50μL生理鹽水涂抹于對照組已脫毛的區域。將丙酮與橄欖油以1∶4比例加入DNCB中混合制成50 g/L和5.0 g/L的DNCB丙酮溶液，將50μL 50 g/L DNCB丙酮溶液涂抹于模型組，哈西奈德組，膚悅康洗劑低、中、高劑量組的脫毛區。1周后進行治療。正常組：100μL生理鹽水涂抹于脫毛區，每周1次，連續3周。模型組：100μL 5.0 g/L DNCB丙酮溶液涂抹于脫毛區，每周1次，共3次；每天2次用生理鹽水浸濕的布敷于豚鼠的脫毛區，15 min后將布拿掉。哈西奈德組：100μL 5.0 g/L DNCB丙酮溶液涂抹于脫毛區，每周1次，共3次；每天2次用浸泡過0.1%哈西奈德溶液的布外敷，15 min后拿掉濕布。膚悅康洗劑低、中、高劑量組：100μL 5.0 g/L DNCB丙酮溶液涂抹于脫毛區，每周1次，共3次；每天2次將浸泡過含有1.2、2.4、3.6 g/mL的膚悅康洗劑的布敷于豚鼠脫毛區，15 min后拿掉濕布。治療21 d后，對傷口的紅斑、水腫和抓痕進行評分，并收集背部皮膚組織用于分析。

1.5觀察指標與方法

1.5.1 觀察皮損情況及計算療效指數 觀察豚鼠紅斑、水腫、抓痕等皮損情況，并計分。紅斑：無，計0分；輕微，計1分；輕度紅斑無結痂，計2分；中度紅斑伴輕度至中度結痂，計3分；重度結痂伴明顯的紅斑，計4分。水腫：無，計0分；輕微，計1分；中等和嚴重，計2分。抓痕：無，計0分；有，計1分。療效指數=（治療前積分-治療后積分）/治療前積分×100%[6，7]。

1.5.2 定量聚合酶鏈反應（qPCR）法檢測白細胞介素（IL）-2、IL-4、IL-17、IL-31、IFN-γ、TGF-β1 mRNA表達水平 抽提總RNA，定量，逆轉錄。各取2μL PCR上游引物和下游引物（具體信息見表1）、2μL模板DNA、0.4μL的50×熒光定量PCR參比染料和3.6μL雙蒸水配成10μL的PCR反應體系，按照如下反應程序進行：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸35 s，進行40個循環后進行檢測。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.5.3 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測豚鼠皮膚組織中IFN-γ和TGF-β1的蛋白水平 將豚鼠皮膚組織完全剪切后放入超聲波細胞破碎儀中進行破碎，加入RIPA和PMSF裂解緩沖液。于4℃18 000 r/min離心60 min后棄去上清。將定量蛋白質與樣品緩沖液以1∶1的比例混合，（100±4）℃煮10 min。通過10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，其中，濃縮凝膠的電壓為75 V，分離凝膠為120 V。之后將蛋白質轉移到PVDF膜上。將膜用5%BSA封閉1 h，加入一抗（抗IFN-γ抗體/抗TGF-β1抗體，兔/小鼠，1∶1 000）4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10 min，然后在室溫下加入二抗孵育1 h。用TBST再次洗滌后，將膜放入暗箱中進行曝光，通過FluorChem M測定目的蛋白質的相對表達水平（p），內參為β-actin。

1.6統計方法采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（s）表示，多組比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1治療21 d后各組豚鼠濕疹的皮損情況治療21 d后，模型組表現出明顯的濕疹反應，其特征為彌漫性紅斑，邊界不清，水腫，血痂及抓痕，背部出現粟粒狀丘疹，類似于人類濕疹的臨床表現；哈西奈德組背部有輕微紅斑，水腫，少量抓痕和結痂的現象；膚悅康洗劑高劑量組與哈西奈德組顯示出相似的治療作用；膚悅康洗劑低、中劑量組治療效果不明顯。見圖1。

2.2各組療效指標比較圖2結果顯示：與正常組比較，模型組療效指數降低（P＜0.05）。與模型組比較，膚悅康洗劑中、高劑量組和哈西奈德組療效指數升高（P＜0.01或P＜0.001），且膚悅康洗劑的作用效果呈劑量依賴性。

2.3各組豚鼠皮膚組織IL-2、IL-4、IL-17、IL-31、IFN-γ、TGF-β1 mRNA表達比較圖3結果顯示：與正常組比較，模型組豚鼠皮膚組織IL-4、IL-17、IL-31、TGF-β1 mRNA表達水平升高（P＜0.05），IL-2、IFN-γmRNA表達水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，膚悅康洗劑低、中、高劑量組和哈西奈德組豚鼠皮膚組織IL-4、IL-17、IL-31、TGF-β1 mRNA表達水平降低（P＜0.001），IFN-γmRNA表達水平顯著升高（P＜0.001），膚悅康洗劑高劑量組IL-2 mRNA表達水平升高（P＜0.001），且膚悅康洗劑的作用效果呈劑量依賴性。

2.4各組豚鼠皮膚組織IFN-γ、TGF-β1蛋白表達比較圖4結果顯示：與正常組比較，模型組豚鼠皮膚組織IFN-γ蛋白表達水平降低（P＜0.05），TGF-β1蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，膚悅康洗劑低、中、高劑量組及哈西奈德組皮膚組織IFN-γ蛋白表達水平升高（除膚悅康洗劑低劑量組，P＜0.01或P＜0.001），TGF-β1蛋白表達水平降低（P＜0.01或P＜0.001），且膚悅康洗劑的作用效果呈劑量依賴性。

圖1 治療21 d后各組豚鼠濕疹的皮損情況Figure 1 Comparison of the skin lesions of guinea pigs with eczema in various groups after 21-day treatment

圖2 各組療效指數比較Figure 2 Comparison of the curative efficacy index in various groups（s）

圖3 各組皮膚組織IL-2、IL-4、IL-17、IL-31、IFN-γ、TGF-β1 mRNA表達比較Figure 3 Comparison of the mRNA expression levels of IL-2，IL-4，IL-17，IL-31，IFN-γand TGF-β1 in skin tissues of various groups（s，n=3）

圖4 各組皮膚組織IFN-γ和TGF-β1蛋白表達比較Figure 4 Comparison of the mRNA expression levels of IFN-γand TGF-β1 in skin tissues of various groups（-x±s，n=3）

3 討論

濕疹是一種過敏性皮膚病，病因復雜，其特征是反復發作，有明顯瘙癢和多形性病變[8]。其病因主要是致敏物質的敏化特性和宿主對外源性過敏原的反應[9]。有證據表明，濕疹是一種與免疫調節障礙有關的疾病，濕疹患者的皮膚炎癥因子表達量明顯高于正常人，其中，CD4+T輔助T（Th）細胞在免疫疾病中發揮重要作用[10]。各種促炎細胞因子刺激抗原呈遞細胞（APC），然后將初始T細胞極化 為Th1、Th2、Th17[11，12]。Th1細胞 分 泌IL-2、IFN-γ、TNF-β1及其他細胞因子[13，14]，Th2細胞分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等細胞因子[15，16]，主要介導體液免疫。近年來，有研究發現濕疹患者調節性T細胞功能下降或受損會減弱對Th2細胞的抑制作用，Th1/Th2漂移是濕疹發病和復發的主要機制[17]。近期的研究發現，Th17細胞及相關的細胞因子IL-17/IL-23參與了濕疹的發病，并且影響著疾病的嚴重程度，IL-31作為新發現的與皮膚慢性炎癥和瘙癢相關的細胞因子，在特應性皮炎患者中的表達也有升高的趨勢。TGF-β在細胞免疫調節方面有著重要的作用，能夠抑制絲裂原、同種異體抗原刺激的免疫系統中T細胞的增殖[18-20]。

濕疹作為一種慢性皮膚病，在常規治療中長期使用激素，這種治療方法會產生一系列副作用[21，22]，如耐藥性、皮膚角質層變薄、毛細血管擴張等。因此尋找一種療效好而副作用少的治療方法是目前治療濕疹的新方向，膚悅康洗劑中含有許多具有免疫調節作用的中草藥成分，從中醫理論或現代免疫學來看，膚悅康洗劑具有很大的潛在功效[3]。

對豚鼠的耳朵反復涂抹DNCB已被證實是一種接觸性濕疹的新動物模型[23]。本研究結果顯示：治療21 d后，膚悅康洗劑高劑量組可有效消除紅斑、水腫和鱗屑，與哈西奈德組的結果相似。膚悅康洗劑低、中、高劑量和哈西奈德組療效指數較模型組升高，且膚悅康洗劑的作用效果呈劑量依賴性。低、中、高劑量膚悅康洗劑可使濕疹模型豚鼠皮膚組織升高的IL-4、IL-17、IL-31和TGF-β1表達水平明顯降低，使降低的IL-2、IFN-γ水平顯著提高，且膚悅康洗劑的作用效果呈劑量依賴性。IFN-γ和TGF-β通常被認為是Th1和Th2的特征性細胞因子。這表明膚悅康洗劑可通過調節皮膚TGF-β和IFN-γ的水平來維持Th1/Th2細胞因子的動態平衡。

綜上所述，膚悅康洗劑對豚鼠因DNCB引起的濕疹有良好的治療作用，其機制可能與調控Th1/Th2的平衡有關。膚悅康洗劑能降低皮膚組織中IL-31的表達水平，緩解皮膚瘙癢引起的皮膚糜爛等問題，這為臨床治療濕疹提供了一種新的有效的方法。本研究就膚悅康洗劑對濕疹的治療機制進行了探討，同時對膚悅康洗劑治療濕疹的用量范圍進行了摸索。我們在今后的研究將繼續探究膚悅康洗劑安全性方面的問題和治療濕疹具體的用量問題。