生物誘導(dǎo)法誘導(dǎo)降香檀結(jié)香的研究

汪金玉， 蔡丹燕， 林勵， 李靜， 李智

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510006；2.茂名市食品藥品檢驗所，廣東茂名 525399）

豆科黃檀屬植物降香Dalbergia odorifera T.Chen（中國植物志），《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）亦稱降香檀，別名降香黃檀、海南黃花梨、花梨木等，主要分布于我國海南省，廣東各地也有批量引種[1-3]。降香是我國國家標(biāo)準(zhǔn)5屬8類34種最珍貴紅木的品種之一[4]，其莖干和根部干燥心材為名貴中藥材降香，在藏醫(yī)學(xué)和傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中使用已有上千年的歷史，現(xiàn)為《中國藥典》收載的唯一降香基原。目前，國內(nèi)外對降香檀的研究主要集中在栽培種植[5，6]、化學(xué)成分分析及藥效等方面[7-16]，鮮見為解決降香資源的可持續(xù)開發(fā)及利用問題進(jìn)行的研究。降香藥用部位為心材（即結(jié)香），其生長周期較長，一般需10年左右才能初步結(jié)香，30年以上才能成材。自然生長的降香，在自然傷害條件下，包括雷擊、蟻穴和昆蟲啃食等，會在傷口附近產(chǎn)生少量降香心材類物質(zhì)，但產(chǎn)量很低。我國野生降香檀基本采伐殆盡，雖然已有一定的人工種植面積，但由于生產(chǎn)技術(shù)落后，尤其是結(jié)香技術(shù)尚未能取得重大突破，迄今市場上尚鮮見家種降香檀產(chǎn)出的優(yōu)質(zhì)降香藥材[17]。國內(nèi)也有個別團(tuán)隊對縮短降香結(jié)香技術(shù)進(jìn)行研究[18-20]，并取得一定成果，方法包括水分脅迫、誘導(dǎo)液誘導(dǎo)、真菌誘導(dǎo)等等，但這些方法普遍存在所產(chǎn)心材量低、不能達(dá)到整體結(jié)香、產(chǎn)量低等缺陷。因此，研究高產(chǎn)、高效及高質(zhì)量的人工誘導(dǎo)降香整體結(jié)香的方法仍是亟待解決的難題。本研究將對團(tuán)隊自主研發(fā)的生物誘導(dǎo)劑與目前常用的誘導(dǎo)結(jié)香液青鮮素、雙氧水、乙酸、甲酸、噻苯隆等進(jìn)行對比，以探尋較優(yōu)的誘導(dǎo)降香結(jié)香液，本研究對于推動降香產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及保護(hù)降香珍稀藥用資源具有重要意義，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器安捷倫6780氣相色譜—質(zhì)譜（GC-MS）（美國安捷倫公司）；XT220A型分析天平（d=0.000 01 g，瑞士Precisa公司）；BP211D型分析天平（d=0.000 1 g，德國Sartorius公司）；DFY-200型粉碎機(jī)（浙江溫嶺大德中藥機(jī)械有限公司）；1 000 mL植物綠化輸液袋；妙達(dá)MOSTA/18V電鉆（廣東妙達(dá)工具有限公司）；日本ARS愛麗斯G-18L折疊鋸等。

1.2試劑生物誘導(dǎo)劑為本室自創(chuàng)的降香誘導(dǎo)結(jié)香液，已獲國家發(fā)明專利（專利授權(quán)號：ZL201510074009.1）。青鮮素、雙氧水、乙酸、甲酸、噻苯隆、乙醚、無水硫酸鈉均為分析純。

1.3試藥降香對照藥材（購自中國食品藥品檢定研究院，批號：120952-201108）；降香檀揮發(fā)油對照品（購于廣東省藥品檢驗所，批號：111579-200201）；降香結(jié)香材料為廣東省茂名高州市降香檀基地（110°36′46″E，21°42′34″N，海拔150～162 m），實驗材料為試驗區(qū)4年生降香黃檀，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院林勵研究員鑒定，其原植物為豆科黃檀屬降香黃檀Dalbergia odorifera，以上憑證標(biāo)本保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院實驗中心。

1.4實驗方法

1.4.1 實驗樹體的選擇 選取原則：4年生降香檀樹，樹干直徑大于7 cm（離地1.20 m處），樹體筆直、外觀健康，無蟲蛀、無霉變，分叉合理，見光度較好，主干無結(jié)香痕跡。按順序進(jìn)行編號處理，每組3個重復(fù)。分別記錄各樹的莖高、胸徑、樹的情況（受光、長勢等）及試驗點小環(huán)境，評估試驗前樹的總體情況，拍照并繪制分布圖。

1.4.2 誘導(dǎo)方法 生物誘導(dǎo)劑、青鮮素、雙氧水、乙酸、甲酸、噻苯隆均用去離子水按體積比濃度配置到8%。在距離地面高度0.8～1.2 m處，垂直樹體方向用電鉆對稱開直徑約0.5 cm的小孔，孔深約7 cm，試藥通過輸液袋輸送給樹體吸收，待吸收完全后，拔出插頭即可。每株給藥100 mL，其中空白對照組僅打孔不給藥，陰性對照組給予去離子水。

1.4.3 觀察指標(biāo) 樹的總體生長狀況：觀察記錄誘導(dǎo)后樹干、枝條、樹葉生長情況，觀察期分別為誘導(dǎo)后1周、2個月、4個月、6個月。處理部位變化情況：鉆孔觀察記錄誘導(dǎo)后2個月、4個月及6個月心材形成情況，包括心材長度、心材直徑、心材顏色及氣味等。

1.4.4 心材揮發(fā)油質(zhì)量檢測 取生物誘導(dǎo)法組心材（誘導(dǎo)后6個月及12個月時），依照《中國藥典》2015年版第四部通則2000中藥其他方法項下2204揮發(fā)油測定法，提取其中揮發(fā)油，計算揮發(fā)油含量，并按氣相色譜—質(zhì)譜（GC-MS）法比較分析揮發(fā)油的組分。

GC-MS色譜條件為HP-5石英毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度250℃；接口溫度280℃；載氣：氦氣；流速：1 mL·min-1；分流比50∶1；進(jìn)樣量：1μL。升溫程序：柱溫60℃，保持2 min，以10℃·min-1升至115℃，保持2 min，再以1℃·min-1升至135℃，保持2 min，最后以10℃·min-1升至280℃，保持2 min。

2 結(jié)果與分析

2.1降香實驗樹生長情況經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，不同誘導(dǎo)處理的各組降香植株生長狀況組內(nèi)基本一致，組間則存在一定差異。空白對照組、陰性對照組及雙氧水組在6個月內(nèi)生長基本無明顯變化，青鮮素組、甲酸組及乙酸組在觀察期內(nèi)總體生長正常，樹葉少量變黃及脫落，約4個月時恢復(fù)正常。噻苯隆組1周內(nèi)樹葉大量脫落，隨后長出新芽。生物誘導(dǎo)組亦于1周時出現(xiàn)少量樹葉脫落，2個月時發(fā)現(xiàn)偶有內(nèi)含白色菌絲的細(xì)小分枝枯死，且有新芽和新枝長出，提示植株已進(jìn)入修復(fù)生長階段，4個月時始現(xiàn)植株樹皮局部爆裂現(xiàn)象。各組具體生長情況見表1。由表1可知，生物誘導(dǎo)法對降香植株生長有顯著影響。

表1 不同處理降香樹生長情況表Table 1 The growth situation of the plants given by different treatments （n=3）

表2 不同誘導(dǎo)組心材長度變化情況Table 2 The changes of heartwood length in different induction groups （s，n=3）

表2 不同誘導(dǎo)組心材長度變化情況Table 2 The changes of heartwood length in different induction groups （s，n=3）

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白組比較；③P＜0.01，與生物誘導(dǎo)劑組比較

組別空白對照組陰性對照組青鮮素組甲酸組雙氧水組乙酸組噻苯隆組生物誘導(dǎo)劑組6個月0.00±0.00③0.00±0.00③5.33±5.03③16.33±5.13②③0.00±0.00③21.33±4.732③48.00±11.27②③157.67±25.42②1周0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 2個月0.00±0.00③0.00±0.00③0.00±0.00③0.00±0.00③0.00±0.00③1.67±2.89③8.00±3.00①③46.00±11.00②4個月0.00±0.00③0.00±0.00③4.33±4.04③10.67±2.31②③0.00±0.00③11.00±2.65②③20.67±3.06②③90.00±13.45②

2.2降香實驗樹心材形成情況空白對照組、陰性對照組及雙氧水組在誘導(dǎo)后2、4、6、12個月中均未形成紅色心材類物質(zhì)，無香味；青鮮素組、甲酸組及乙酸組多在誘導(dǎo)后2個月時，誘導(dǎo)孔周圍有紫褐色滲出物，6個月時鑿開觀察，所形成心材類物質(zhì)長度6～25 cm不等，直徑約1.2～2.5 cm，顏色淡紅，香氣淡；噻苯隆組及生物誘導(dǎo)法組形成心材類物質(zhì)較多，均于誘導(dǎo)后1周誘導(dǎo)孔周圍即出現(xiàn)紫褐色滲出物，2個月時便有心材形成，6個月后鑿開觀察，心材呈紫紅色，香氣濃，其中噻苯隆組心材平均長度約20 cm，直徑約1.5 cm，生物誘導(dǎo)法組心材平均長度達(dá)158 cm，直徑約4.6 cm。各組心材形成情況見表2、3，圖1、2。

由組間分析比較結(jié)果可知，誘導(dǎo)后4個月起，甲酸組、醋酸組、噻苯隆組及生物誘導(dǎo)劑組，4組所形成的心材長度及直徑與空白對照組均存在顯著性差異（P＜0.01）。該4組中甲酸組、醋酸組的長度和直徑，以及噻苯隆組的長度，與生物誘導(dǎo)劑組均存在顯著性差異（P＜0.01）。噻苯隆組的直徑與生物誘導(dǎo)劑組差異性不顯著。

上述結(jié)果表明，相對于其他各組，生物誘導(dǎo)劑組降香植株心材長度和直徑均具有明顯優(yōu)勢，成材量較大，且成材時間較早。

2.3生物誘導(dǎo)劑組心材揮發(fā)油質(zhì)量分析分別取生物誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后6個月及12個月的心材，行“1.4.4”項下檢測方法，結(jié)果誘導(dǎo)后6個月樣品的揮發(fā)油含量為1.92%，誘導(dǎo)后12個月樣品的揮發(fā)油含量為3.85%，均符合《中國藥典》規(guī)定的不低于1%的要求。

按“1.4.4”項下色譜條件，對降香油對照品進(jìn)行GC-MS分析，以NIST Mass Spectral Database檢索及人工解析其化學(xué)結(jié)構(gòu)，從中分離并鑒定了11個萜類成分，分別為香葉基丙酮、反式-β-金合歡烯、金合歡醇、環(huán)氧化沒藥烯、a-檀香醇、異香橙環(huán)氧化物、環(huán)氧化蛇麻烯、反式-橙花叔醇、β-甜沒藥烯、石竹烯氧化物及甜沒藥醇，見圖3。其中以環(huán)氧化蛇麻烯、反式-橙花叔醇及β-甜沒藥烯3個成分為主要組分。

同樣，按“1.4.4”項下色譜條件，對生物誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后6個月和12個月的心材，以及對照藥材中的揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分析，通過儀器自帶RTE積分器，以峰面積歸一化法計算求得各成分在各樣品中的相對百分含量，結(jié)果見表4。

表3 不同誘導(dǎo)組心材直徑變化情況表Table 3 The changes of heartwood diameter in different induction groups （s，n=3）

表3 不同誘導(dǎo)組心材直徑變化情況表Table 3 The changes of heartwood diameter in different induction groups （s，n=3）

①P＜0.01，與空白組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與生物誘導(dǎo)劑組比較

組別空白對照組陰性對照組青鮮素組甲酸組雙氧水組乙酸組噻苯隆組生物誘導(dǎo)劑組1周0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 2個月0.00±0.00③0.00±0.00③0.00±0.00③0.00±0.00③0.00±0.00③0.17±0.29③1.00±0.20①②2.27±0.68①6個月0.00±0.00③0.00±0.00③1.13±1.10②1.60±0.40①③0.00±0.00③2.10±0.36①②3.47±0.31①4.63±0.97①4個月0.00±0.00③0.00±0.00③1.00±1.00③1.30±0.17①③0.00±0.00③1.17±0.12①③2.23±0.25①③3.53±0.31①

圖1 不同誘導(dǎo)組心材長度對比Figure 1 Comparison of the heartwood length in different induction groups

圖2 不同誘導(dǎo)組心材直徑對比Figure 2 Contrast of the heartwood diameter in different induction groups

3 討論

經(jīng)外界干預(yù)后降香檀植株生長情況與心材形成密切相關(guān)，能在短期內(nèi)形成心材者，都曾不同程度地出現(xiàn)樹葉枯黃、脫落，生物誘導(dǎo)劑組甚至可出現(xiàn)細(xì)枝枯死、樹皮爆裂等現(xiàn)象，短期內(nèi)可顯著影響植株生長，且該組植株心材產(chǎn)量及質(zhì)量均顯著優(yōu)于其他試驗組。

實驗中，各不同誘導(dǎo)組所形成心材的長度和直徑，組內(nèi)雖存在一定的差異，但整體趨勢趨于一致，唯獨青鮮素組出現(xiàn)了較大的偏離現(xiàn)象，其原因可能系因樹的個體差異，或青鮮素誘導(dǎo)法所存在的不穩(wěn)定性。這些結(jié)果均在表2和表3的統(tǒng)計數(shù)據(jù)中得以體現(xiàn)。

表4結(jié)果顯示，3種樣品中均主要含環(huán)氧化蛇麻烯、反式-橙花叔醇及β-甜沒藥烯。生物誘導(dǎo)法誘導(dǎo)降香檀6個月的心材揮發(fā)油含反式-橙花叔醇高達(dá)50.295%，但此時β-甜沒藥烯及環(huán)氧化蛇麻烯含量仍較低，繼續(xù)生長6個月后，此兩種成分均顯著升高，而反式-橙花叔醇相對降低。與對照藥材相對比，3種主要成分總相對百分含量并無明顯差異。降香植株經(jīng)生物誘導(dǎo)法誘導(dǎo)后6個月和12個月所形成的心材含油量均已達(dá)到國家藥典標(biāo)準(zhǔn)，其油中組分結(jié)構(gòu)與對照藥材相似。

圖3 降香油對照品總離子流圖Figure 3 Totalion chromatorgram of controlsample of volatile oils from Dalbergia odorifera

表4 各樣品揮發(fā)油主要組分相對百分含量分析表Table 4 The relative percentage of main components in volatile oils from samples

揮發(fā)油成分是降香主要化學(xué)成分，其主要含萜烯類物質(zhì)，其中以橙花叔醇成分為鑒定降香的標(biāo)志性成分。本研究檢測了生物誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后6個月、12個月所形成心材的揮發(fā)油含量，并就其揮發(fā)油中主要組分種類及相對百分含量，與對照藥材進(jìn)行了比較。誘導(dǎo)后2個月、4個月時，因恐影響樹木生長，不便大量采樣，而導(dǎo)致樣品量不足，故未能檢測該時間下的心材質(zhì)量。

本研究結(jié)果表明，與青鮮素、雙氧水、乙酸、甲酸、噻苯隆等常用誘導(dǎo)結(jié)香液相比，生物誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)處理能使降香植株快速形成質(zhì)量較佳的心材，且所形成心材的區(qū)域顯著大于其它組，心材物質(zhì)呈紅褐色、質(zhì)硬、紋理清晰、香氣濃烈、油性足，揮發(fā)油含量符合《中國藥典》要求，值得對生物誘導(dǎo)劑開展進(jìn)一步深入研究。