不同貯存方法對紫花苜蓿種子內生根瘤菌數量變化的影響

金曉玲

（慶陽市畜牧技術推廣中心，甘肅 慶陽 745000）

紫花苜蓿屬豆科植物，根瘤菌可與其共生形成根瘤，這一共生體系的共生固氮作用不僅具有巨大的經濟和社會效益，同時在改善生態(tài)環(huán)境等方面具有重要意義。苜蓿多采用種子繁殖，種子用量很大但不耐貯藏（Lopez et al,2001)。已報道苜蓿種子內攜帶根瘤菌，但由于儲藏時溫度及儲藏方式等，常常會影響到種帶根瘤菌數量。因此，適應的貯藏溫度利于體內根瘤菌的繁殖。此外，種子含水量也會影響種子活力。霍平慧等（2011）采用硅膠室溫干燥法對隴東紫花苜蓿進行了超干處理，使種子含水量由9.03%(CK)分別降至7.09%、6.93%、6.36%、5.72%、5.46%、5.18%、4.97%和4.59%，4.59%；之后將種子用雙層鋁箔紙密封，置于盛滿硅膠的干燥皿中，室溫(23～26℃)下貯藏一年，結果顯示不同程度的干燥脫水對種子活力有顯著影響。雖然國內外對溫度或者含水量對種子生長影響有所研究，但是對于溫度和含水量兩者相互交叉作用對種子根瘤菌影響的研究報道目前尚少。

因此，本試驗以含根瘤菌的紫花苜蓿種子為試驗材料，分別用不同溫度和包裝條件貯存，研究種子內根瘤菌存活和增殖的適宜條件，通過不同保存方式對含根瘤菌種子內根瘤菌增殖的影響，繼而篩選出最適保存條件，為獲得含有大量根瘤菌的苜蓿種子奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘農5號紫花苜蓿(medicago sativa L.Gannong No.5) 在結莢期以切主根澆灌、根部直接澆灌、加入600 mg/ml苦參堿（濃度1.3%）澆灌三種接種方法接種兩種熒光標記根瘤菌（Sinorhizobium meliloti.12531f（S.12531f）和 Rhiz obium meliloti.GN5f（R.GN5f）。結莢期收獲種子，未進行標記根瘤菌接種的處理為對照。室內風干2個月進行不同方法的貯存。

1.2 試驗方法

1.2.1 含熒光標記根瘤菌種子的貯存 根瘤菌生長的臨界低溫值為-10℃（祁娟，2006），最高適應生長溫度為28℃，因此本次設定25℃（室溫），4℃（低溫），-4℃（超低溫），采用鋁箔紙（種子用鋁箔紙密封包裝)、信封加布袋（種子裝于布袋內，外加信封袋）、信封袋3種包裝方式貯存處理；以用紙質信封袋包裝后置于有干燥硅膠的干燥器內在室溫下貯存處理為對照，貯藏6個月后測定種子內生根瘤菌數量。

1.2.2 種子內根瘤菌數量的檢測 貯存6個月后隨機挑選各處理種子25粒，重復4次，放入50 ml無菌三角瓶內，加入碘伏消毒液(有效碘濃度為2500 mg/L)淹沒浸泡消毒3 min后無菌水沖洗5次，至三角瓶內無泡沫狀液體出現。以上均在無菌環(huán)境內進行。表面消毒后，將最后一次消毒的植物器官各面在培養(yǎng)基平板上印一下，28℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察有無菌落產生，以驗證消毒是否徹底。若有菌落長出則再次消毒(遲峰,2006)。消毒后的種子各部位置于無菌研缽中，加入2 ml無菌水研磨，研磨液離心（4 000 rpm/min，2 min）后依次吸取0.2 ml上清液均勻涂布于含剛果紅YMA固體培養(yǎng)中，28℃培養(yǎng)24 h后黑暗中記錄每培養(yǎng)皿中根瘤菌單菌落數量。（剛果紅YMA培養(yǎng)基中，根瘤菌形態(tài)為含有粘質胞外多糖且不吸附色素的白色半透明菌落，形態(tài)為平坦凸起或半透明凸起，邊緣光滑）（霍平慧,2014）。

1.3 數據處理

用Excel2007軟件進行數據整理，SPSS20.0.0軟件進行統(tǒng)計和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 常溫（25℃）不同貯存方法對不同處理種子內生根瘤菌數量的影響

如圖1所示，常溫信封貯存條件下，G切種子的保存效果最好，根瘤菌數量數量最多，達到380.0/cfu·25粒-1，與鋁箔和信封+布袋的貯存條件相比，差異顯著；G澆處理鋁箔貯存條件下內生根瘤菌數量顯著高于其他兩種包裝材料，數量為197.5/cfu·25粒-1；1澆在信封和鋁箔貯存條件下數量顯著高于信封+布袋處理，但二者之間差異不顯著；CK種子在鋁箔包裝條件下效果好，達260.5/cfu·25粒-1，顯著高于其他兩種處理。其余不同處理不同包裝材料間種子內生根瘤菌數量無顯著性差異。

圖1 常溫（25℃）不同貯存方法下不同處理種子內生根瘤菌數量變化

2.2 常溫（25℃）干燥不同貯存方法對不同處理種子內生根瘤菌數量的影響

如圖2所示，常溫（25℃）干燥信封+布袋保存條件下，1澆種子保存效果最好，內生根瘤菌數量顯著高于其他處理，數量達1021/cfu·25粒-1。G切在鋁箔貯存條件下根瘤菌數量顯著高于其他兩種包裝方法，達332.0/cfu·25粒-1；G澆處理內生根瘤菌數量在信封包裝條件下顯著高于其他處理，達552/cfu·25粒-1；G+苦在信封包裝條件下內生根瘤菌數量顯著高于其他兩種處理，數量為385.0/cfu·25粒-1；CK種子內生根瘤菌數量最少，僅為58.5/cfu·25粒-1，且三種包裝材料間無顯著性差異。

圖2 常溫（25℃）干燥不同貯存方法下不同處理種子內生根瘤菌數量變化

2.3 4℃不同貯存方法對不同處理種子內生根瘤菌數量的影響

如圖3所示，在4℃鋁箔包裝條件下1澆種子內生根瘤菌數量顯著高于其他處理，數量達259.5/ cfu·25粒-1。G切處理各包裝材料間無顯著性差異；G澆在信封貯存條件下內生根瘤菌數量顯著高于另兩種材料，為136.0/cfu·25粒-1；其余四種處理不同包裝材料間差異不顯著。

圖3 4℃不同貯存方法下不同處理種子內生根瘤菌數量變化

2.4 -4℃不同貯存方法對不同處理種子內生根瘤菌數量的影響

如圖4所示，-4℃下，G切種子在信封貯存條件下根瘤菌數量最多達638.5/cfu·25粒-1，顯著高于其它兩種包裝材料；G+苦鋁箔保存條件下根瘤菌數量達625.0/cfu·25粒-1，顯著高于其他兩種包裝處理；1切和1澆在鋁箔包裝條件下數量最高分別為374.5/cfu·25粒-1和312.0/cfu·25粒-1，但與信封+布袋無顯著性差異；G澆/1+苦和CK各包裝材料間差異不顯著，最多分別為305.5/cfu·25粒-1、213.5/cfu·粒-1和73.5/cfu·25粒-1。

圖4 -4℃不同貯存方法下不同處理種子內生根瘤菌數量變化

3 討論

適宜的貯藏溫度和良好的貯藏條件是種子內生根瘤菌繁殖的關鍵因素。每種微生物都有其適宜的生長溫度范圍。本試驗在4℃貯存時各處理種子內生根瘤菌最高數量均低于其他三個溫度的貯存數量，以25℃干燥信封+布袋貯存1澆種子內根瘤菌數量最多，由此說明選取的三種溫度均未達到根瘤菌生長最低限，但因種子外包裝材料及菌種特性從而影響種子內生根瘤菌的繁殖。

含水量是保持種子活力和生活力的關鍵因素之一。已有研究認為貯藏種子含水量低于5%，將導致種子活力下降(Buitinket al,1999;McDonald ,1999)。本研究發(fā)現25℃貯存時，干燥條件除G切和對照外，各處理種子內根瘤菌數量均高于未干燥處理，由此表明水分同樣影響種子內根瘤菌的繁殖。

相同溫度貯存條件下，不同包裝材料對不同處理種子內根瘤菌數量影響不同。常溫時，信封貯存G切種子效果明顯優(yōu)于其他兩種包裝材料，鋁箔貯存G澆和CK種子效果明顯優(yōu)于其他兩種包裝材料，其余處理不因包裝材料不同而不同；25℃干燥時，鋁箔貯存G切，信封貯存G澆、G+苦種子，信+布貯存1澆種子時效果明顯優(yōu)于其他兩種包裝材料，4℃鋁箔貯存1澆種子時效果明顯優(yōu)于其他兩種包裝材料，-4℃時鋁箔貯存G切和G+苦種子時效果明顯優(yōu)于其他兩種包裝材料，其余各包裝材料在相同溫度下并未影響種子內根瘤菌數量。由此表明包裝材料對內生根瘤菌數量的影響因溫度不同而不同，進而表明溫度和含水量是共同影響種子內根瘤菌存活的因素。

本試驗中，適宜種子內生根瘤菌增殖的溫度為25℃干燥或-4℃，表明接種根瘤菌后苜蓿種子適宜在常溫干燥或低溫環(huán)境下貯存，但由于種子貯存過程中含水量較難控制，環(huán)境會影響含水量的變化，因此，生產實踐中-4℃更利于種子的貯存，而該溫度下，鋁箔包裝材料下種子內根瘤菌數量較多。

因此，從生產實踐及種子貯存的方便性考慮，-4℃鋁箔紙密封保存更利于種子內根瘤菌的增長和繁殖，但利于更多根瘤菌在種子內繁殖并獲得穩(wěn)定高產植株的種子貯存條件仍有待于進一步研究。

4 結論

溫度和水分共同影響紫花苜蓿種子內根瘤菌的繁殖，綜合生產實踐條件，得出-4℃更利于根瘤菌在種子內繁殖；鋁箔保存效果優(yōu)于信封和信封+布袋。