固原地區雞輸卵管炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗

安慧慧

（固原市原州區動物疾病預防控制中心，寧夏 固原 756000）

產蛋雞輸卵管炎是蛋雞常見的繁殖障礙疾病，主要經呼吸道、消化道感染,臨床上主要表現為蛋雞無產蛋高峰,產畸形蛋、軟殼蛋、血絲蛋和薄殼蛋等[1]，引起輸卵管炎的原因主要是因為雞舍衛生條件太差，泄殖腔被細菌（如白痢沙門氏菌、大腸桿菌等）污染而侵入輸卵管導致雞死于輸卵管炎和腹膜炎。近幾年，隨著養雞業的不斷發展，飼養規模的擴大，禽大腸桿菌病已成為危害養雞業的重要傳染病之一。對該病進行有效的防控對養雞業健康發展至關重要，而抗菌藥物的合理與有效使用是控制與防治[2]該病的重要環節。

由于家禽養殖者不科學使用抗生素，導致大腸桿菌病耐藥性不斷增加，防治難度越來越大[3]，為了有效防治本病，必須定期了解其對各種抗菌藥物的敏感程度，以指導臨床抗菌藥物的合理使用。本試驗通過臨床癥狀，尸體剖檢初步診斷為慢性輸卵管炎，經微生物學檢查診斷為致病性大腸桿菌。同時對輸卵管炎病例進行病原菌的分離鑒定，并用12種常用抗菌藥物對分離出的致病性菌株做進一步的藥物敏感性試驗，篩選出比較敏感的藥物，為臨床防治雞輸卵管炎提供數據參考。

1 材料

1.1 試驗病料及供試動物

在寧夏固原某養雞場兩棟雞舍中采集病料，剖解檢查7只有輸卵管炎的病死雞，無菌采集輸卵管病料，標記清楚，放入37℃恒溫箱中培養以備用，共采集病料7份。7日齡雛雞32只。

1.2 主要儀器設備

XSP-3C生物顯微鏡（上海長方光學儀器有限公司）、DNP-9052電熱恒溫培養箱（上海鴻都電子科技有限公司）、DNG-9030電熱恒溫干燥箱（上海鴻都電子科技有限公司）、JP-500托盤天平（上海新諾儀器設備有限公司）、280A高壓蒸汽滅菌鍋（合肥華泰醫療設備有限公司）等設備。

1.3 試驗試劑及藥物

革蘭氏染色液（ABCD）天津傲然精細化工研究所；麥康凱瓊脂購自北京奧星生物技術有限公司；普通營養瓊脂購自北京奧星生物技術有限公司；三糖鐵瓊脂購自北京三藥科技開發公司；LB培養基購自北京奧星生物技術有限公司。葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、枸櫞酸鹽、M.R試劑、V-P試劑、硝酸鹽試劑等。

鏈霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氯霉素、土霉素、環丙沙星、卡那霉素、四環素、頭孢哌肟、培氟沙星、慶大霉素、頭孢哌酮，均購自上海伊華醫學科技有限公司。

2 方法

2.1 培養基的制備

按成品營養瓊脂、麥康凱、三糖鐵、LB培養基的說明書正確稱取原料，按照配方配置培養基。高壓蒸汽滅菌20 min，將滅菌的營養瓊脂，麥康凱培養基趁熱倒入已滅菌好的培養皿中，每個皿中倒15～20 ml，將分裝好的培養基放在無菌臺上過夜，第二天包裹并做標記。將三糖鐵趁熱分裝入試管，10～15 ml/支，完成時傾斜15～20°，第二天放于試管架上并標記。用吸管吸取LB溶液于小試管中，5 ml/支，放于試管架上并標記，將以上標記好的培養基放入4℃冰箱備用。

2.2 病原菌的分離提純

將有細菌生長的LB液用接種環接種到營養瓊脂培養基上，加蓋標記，倒放于恒溫箱37℃培養24 h后觀察菌落生長情況，然后挑取營養瓊脂上的單個菌落在營養瓊脂上進一步純化。

2.3 病原菌的鑒定

染色鏡檢：選擇干凈的載玻片，用移液器吸一滴生理鹽水于載玻片上，用滅菌的接種棒挑營養瓊脂純培養基上單個菌落少許于生理鹽水上，均勻涂布，自然干燥后用火焰固定，進行染色。吸取草酸銨結晶紫溶液進行染色，作用1～2 min水洗；吸取革蘭氏碘溶液于抹片上媒染，作用1～3 min水洗；吸取95%酒精于抹片上脫色，約0.5～1 min水洗；吸取稀釋的石炭酸復紅染10～30 s水洗，染完后自然干燥，鏡檢。挑取分離純化的單個菌落，進行革蘭氏染色、鏡檢，觀察其形態特征。

麥康凱培養基：將提純的大腸桿菌單個菌落挑起，用滅菌的接種環挑取營養瓊脂純培養基上菌落接種到麥康凱培養基上，恒溫箱37℃培養24 h后觀察。

三糖鐵培養基：將提純的大腸桿菌接種在三糖鐵瓊脂斜面，恒溫箱37℃培養24 h后觀察。

2.4 生化試驗

對分離菌株進行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、M.R、V-P、枸櫞酸鹽、硝酸鹽還原試驗9項生化指標的測定。

2.5 致病力試驗

將供試動物隨機分成8組，把分離鑒定的菌株接種到LB培養基上，恒溫箱37℃培養24 h。實驗組以0.2 ml/只頸背部皮下注射LB有菌液，對照組4只注射相同劑量的滅菌生理鹽水，隔離飼養，觀察并記錄發病情況。剖檢病死雛雞，觀察其病理變化，并無菌采取死亡雛雞的肝臟，接種麥康凱平板分離培養細菌、涂片、染色鏡檢、生化反應，鑒定是否與分離菌相同。

2.6 藥敏試驗

將鑒定為大腸桿菌的純培養基上的單個菌落接種于LB培養基中，恒溫箱37℃培養24 h。在無菌臺上，取LB培養基搖勻，將LB中的有菌培養液用吸管吸取5 ml，均勻的散布在營養瓊脂表面，將多余的有菌液吸取棄去。用鑷子取藥敏片貼到培養基表面，然后在培養基上劃一個箭頭，箭頭所指的方向為開頭，順次貼藥敏片，貼完后蓋上蓋子，做好相應的標記。將貼好藥敏片的培養基倒放在恒溫箱37℃培養24 h后觀察，用直尺測抑菌圈的直徑并記錄（見表1）。

3 結果與分析

3.1 細菌培養特性

在LB培養基中呈均勻渾濁。營養瓊脂上菌落呈圓形隆起、表面光滑、濕潤、半透明、乳白色。麥康凱培養基上菌落呈圓形凸起，表面光滑、濕潤、邊緣整齊，粉紅色。三糖鐵培養基的斜面和底層均為黃色，底部有氣泡產生。

表1 藥敏片抑菌圈判斷標準

3.2 細菌形態學檢查

病料涂片鏡檢可見，被檢菌為兩端鈍圓的陰性短桿菌，多數散在排列，偶有2～3個連在一起。純培養物革蘭氏染色鏡檢可見，培養物為革蘭氏陰性中等大小的直桿菌，兩端頓圓，單個或成對分布。通過純培養，分離到大腸桿菌7株。

3.3 生化試驗結果

生化試驗結果如表2所示。

表2 生化試驗結果

由表2可知，分離的7株細菌都能夠發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖，產酸產氣，對MR試驗為陽性，V-P試驗、枸櫞酸鹽利用試驗均為陰性，硝酸鹽還原實驗為陽性。綜合以上實驗結果，可確定分離的7株菌為大腸桿菌。

3.4 致病力試驗結果

接種12 h后出現精神沉郁，食欲減退，羽毛松亂等臨床癥狀，接種24～48 h除2株分離菌未造成雛雞死亡，其余5株分離菌均造成雛雞大于2/3死亡，病死雞剖檢的病理變化、涂片、染色鏡檢、生化反應與上述分離菌相同，對照組正常生長，因此在7株分離菌中可確定5株為致病性菌株。

3.5 藥敏試驗結果

5株致病性大腸桿菌藥敏試驗結果如表3所示。

表3 5株致病性大腸桿菌對12種抗菌藥物的耐藥率

由表3可知：分離鑒定的5株致病性大腸桿菌中有4株對恩諾沙星敏感，敏感率達80%，有3株對卡那霉素和頭孢吡肟敏感，敏感率為60%，對其余9種抗菌藥物都有不同程度的耐藥性，其中對氟苯尼考、四環素、土霉素的耐藥率最高，達80%，其次是對鏈霉素、氯霉素、慶大霉素、頭孢哌酮，耐藥率達60%，對環丙沙星、培氟沙星的耐藥率為20%。

4 討論

引起雞發生大腸桿菌病的因素眾多，雞群體內有潛在的致病性大腸桿菌[4]，或與其它病原合并感染，或繼發于其它雞病等。本試驗所選養雞場而言，引起雞發生輸卵管炎性大腸桿菌的主要原因是飼養管理不當，雞舍內衛生狀況較差，通風不良，氨氣濃度高，消毒措施不嚴格，飼喂了發霉變質的飼料，雞群受到強應激而導致機體抵抗力下降，環境中的大腸桿菌乘虛侵入雞群體內引起大腸桿菌病的發生。為了降低雞大腸桿菌病發病機率，應做好日常飼養管理工作。首先要制定嚴格的消毒措施；其次不能飼喂變質的飼料，飲水要清潔；做好雞舍通風和保暖，保持雞舍清潔干凈[5]，降低雞舍空氣中氨氣和粉塵含量，控制雞群密度，減少應激；最后在臨床用藥方面要注意盡量避免長期大量使用同一種藥物，以免產生耐藥性，還應考慮采取聯合用藥、交叉或輪換用藥等方法，才能有效防治大腸桿菌病。