49味中藥及其復方與抗生素對溶藻弧菌的體外抑菌作用

徐曉津，李秀華，馬一帆，李慧耀，祁 欣，陳郁濃，呂海龍，鄢慶枇

49味中藥及其復方與抗生素對溶藻弧菌的體外抑菌作用

徐曉津1,2，李秀華3，馬一帆4，李慧耀1,2，祁 欣1,2，陳郁濃1,2，呂海龍1,2，鄢慶枇1,2

（1. 集美大學 水產學院，福建 廈門 361021；2. 福建天馬科技股份集團有限公司，福建 福州 350308；3. 廈門醫學院附屬第二醫院中醫科，福建 廈門 361021；4. 廈門大學海洋與地球學院，福建 廈門 361005）

篩選對溶藻弧菌（）有抑菌作用的中草藥及其復方以及抗生素。采用改良的牛津杯法對訶子、白芍、甘草等49種單味中藥進行溶藻弧菌體外抑菌試驗，以體外抗菌活性較好的22種藥物，按中藥配伍規則組成二聯、三聯復方，采用生藥質量濃度分別為60、240 mg/mL的中藥進行中藥復方體外抑菌試驗。用抗生素對溶藻弧菌進行藥敏試驗。當單種中藥體外抑菌藥物質量濃度為240 mg/mL時，訶子、烏梅、醋五味子等對溶藻弧菌抑菌作用明顯，為極敏感。在二聯中藥體外抑菌試驗中，當中藥質量濃度為60 mg/mL時，訶子、烏梅組成復方中藥等8種復方對溶藻弧菌協同抑菌作用明顯，為極敏感，藥物質量濃度在240 mg/mL時，訶子與白芍等14種雙聯中藥的協同抑菌作用明顯，為極敏感。在三聯中藥體外抑菌試驗中，在藥物質量濃度60 mg/mL時，訶子、烏梅、蒲公英等組成24種復方中藥按質量比1∶1∶1的抑菌效果極為敏感，藥物質量濃度在240 mg/mL時，黃芩、訶子、黃芪等22復方中藥按質量比1∶1∶1對的抑菌作用明顯，為極敏感。溶藻弧菌對恩諾沙星、鹽酸多西環素、土霉素及甲氧芐啶/磺胺甲噁唑4種藥物高度敏感。18種單味中藥對溶藻弧菌有抑制作用，黃芩、訶子、黃芪等24個三聯復方中藥藥效較強，多個抑菌作用效果良好的三聯復方中藥可用于魚病防治研究。

中藥；抗生素；溶藻弧菌；抑菌作用

溶藻弧菌（）是魚、蝦、貝等海水養殖動物的條件致病菌，在我國南方沿海和臺灣等地區，大黃魚（）[1]、石斑魚（）、卵形鯧鲹（)[2]、紅笛鯛（）等重要經濟魚類易感染溶藻弧菌而發病，死亡率高，對石斑魚的危害尤為嚴重[3]，患溶藻弧菌病的種類包括點帶石斑魚（）、青石斑魚（）、鮭點石斑魚（）和赤點石斑魚（）等，主要表現為敗血癥、爛尾、爛鰓等癥狀，給水產養殖業帶來較大經濟損失[4-11]。在水產養殖中，抗生素和化學抗菌藥廣泛用于預防和治療各種弧菌病，但隨著抗生素的廣泛應用，耐藥性細菌不斷出現，給治療帶來困難。中藥治療細菌性疾病有悠久的歷史，有抗菌作用的中草藥種類多，且有成本低、加工方便、抗菌性好、細菌不易產生耐藥性、能增強魚類免疫力等優點。國內學者已進行少數中草藥飼料添加劑在水產養殖上的應用研究，但如何選擇有效抗菌中藥成為近年來研究的難點。本研究選用49種中藥，通過溶藻弧菌體外中藥單方和復方的體外抑菌試驗，以及溶藻弧菌對抗生素藥敏試驗，篩選有較強抑菌作用的中藥三聯復方，探討其對溶藻弧菌的抑制作用，為石斑魚、大黃魚等海水魚細菌病治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

溶藻弧菌菌液由集美大學水產學院國家海洋局漁用疫苗工程中心實驗室制備、保存[12]。溶藻弧菌分離自患病石斑魚，將溶藻弧菌分別用LB液體培養基培養，28℃下恒溫培養8～12 h，取對數生長期的菌液。磷酸鹽緩沖液（PBS）調整菌液濃度達OD值0.5 (含菌量約為108cfu/mL)，置于4℃冰箱內保存，備用。

1.2 中藥對溶藻弧菌體外抑制試驗

1.2.1 單方中藥的選取與藥液制備 選擇水產養殖生產病害防治有關的49種中藥進行溶藻弧菌體外抑菌試驗。選用艾葉、魚腥草、大黃、黃柏、黃連、黃芩、連翹、板藍根、白茅根、苦參、金銀花、梔子、蒲公英、地錦草、千里光、烏梅、檳榔、榧子、使君子、柴胡、青蒿、槐花、木香、貫眾、炒川楝子、大蒜、螺旋藻、刺五加、黃芪、杜仲葉、穿心連、白芍、醋五味子、黨參、刺五加、枸杞子、大蒜、甘草、地錦草、白頭翁、五倍子、訶子、茯苓、鉤藤、虎杖、柴胡、郁金、炒槐花、野菊花等中藥顆粒劑（均由江陰天江藥業有限公司生產）。所有中藥配方顆粒由公司統一生產，生產過程包括藥材的炮制、濃縮提取、制粒包裝。顆粒劑可溶于水，并保持生藥同樣藥性。將中藥配方顆粒溶解于無菌蒸餾水中，于沸水中熱浴30 min。每包藥標注相當于生藥材質量，據此對各種中藥進行逐一換算濃度、稀釋，將各中藥顆粒劑配成相當于生藥質量濃度分別為60、120、180 mg/mL的溶液。由于多數中藥因濃度太低，藥效不明顯，抑菌圈較小，不利于各中藥藥效的篩選，因此配制相當于生藥的質量濃度為240 mg/mL的中藥顆粒劑溶液，較多藥物對溶藻弧菌有體外抑菌效果，根據其抑制圈大小篩選有效藥物。

1.2.2 復方二聯中藥的選取與藥液制備 選擇1.2.1中有體外抑制作用的18種中藥：訶子、黃連、烏梅、大黃、黃柏、白芍、醋五味子、檳榔、梔子、青蒿、黃芩、連翹、炒槐花、木香、艾葉、炒川楝子、蒲公英、野菊花，根據藥物的特性及養殖生產實踐中復方中藥治療細菌病的研究報道，增加甘草、板藍根、黃芪、貫眾四種單味藥，制定復方二聯中藥組合。復方中藥（中藥顆粒劑溶液）二聯按質量比1∶1，中藥最終相當于生藥的質量濃度為60、240 mg/mL。

1.2.3 復方三聯中藥的選取與藥液制備 按1.2.1方法選擇22種單味中藥配方顆粒，根據藥物的特性及養殖生產實踐中復方中藥治療細菌病的研究報道，制定復方三聯中藥（中藥顆粒劑溶液），復方中藥三聯按質量比1∶1∶1，中藥最終相當于生藥的質量濃度為60、240 mg/mL。

1.2.4 單方、復方二聯、復方三聯中藥體外抑菌活性的測定方法 用改良的牛津杯法對49種單方中藥、復方二聯中藥、復方三聯中藥進行溶藻弧菌體外抑菌試驗。在平板中倒入10 mL滅菌LB固體培養基，待凝固后，在每個培養皿中等距離放入4 個牛津杯，取15 mL的LB培養基混合均勻倒于平板上，待凝固后，取下牛津杯。制備菌懸液，將培養12 h的溶藻弧菌離心，去上清，用PBS重懸，調整(600 nm) = 0.4，取0.1 mL菌懸液滴入平板，涂布均勻，在1個孔中加入200 μL無菌水為對照，其他3個孔中加入含生藥240 mg/mL的3種不同藥液200 μL，置于28℃條件下恒溫培養18 ~ 24 h，用SupcreG1菌落計數/篩選/抑菌圈測量聯用儀（杭州迅數科技有限公司）測量抑菌圈大小，每個試驗重復3次，計算抑菌圈直徑平均值，根據抑菌圈直徑判定其抑菌能力。判定標準：抑菌圈直徑≥20 mm為極敏感；15 mm≤抑菌圈直徑< 20 mm為高度敏感；10 mm≤抑菌圈直徑< 15 mm為中度敏感；抑菌直徑< 10 mm低度敏感或無效。

1.3 溶藻弧菌對抗生素藥敏試驗

用牛津杯法，對恩諾沙星（興化市恒威生物技術有限公司）、鹽酸多西環素（河南海天生物科技有限公司）、土霉素（河南佰吉特生物科技有限公司）、磺胺嘧啶(山東亞康藥業股份有限公司)、氟苯尼考（上海瑞博丘生物工程有限公司）、硫酸新霉素（宜興市蘇亞達生物有限公司）、硫酸慶大霉素（青島富坤獸藥原料有限公司）、磺胺甲噁唑（廣州駿杰生物技術有限公司）進行藥敏試驗，使用劑量參照WHO推薦的K-B紙片瓊脂擴散法中相應的藥物濃度[13]。將溶藻弧菌用8.5 g/L生理鹽水稀釋至1×108cfu/mL，分別取200 μL菌懸液均勻涂布于LB培養基平板，每個平板放置4個牛津杯，每個孔分別加入以上8種抗生素藥液。28℃下恒溫培養24 h后，并用前述SupcreG1菌落計數/篩選/抑菌圈測量聯用儀測量抑菌圈大小，每個平板做3 個重復。根據CLSI M100的最新標準判定溶藻弧菌的敏感性[14]。

2 結果與分析

2.1 不同中藥單方對溶藻弧菌的體外抑制效果

訶子、烏梅、醋五味子對溶藻弧菌抑菌作用較強，為極敏感。檳榔、木香、白芍、艾葉、梔子、黃芩、青蒿抑菌作用較明顯，為高度敏感。連翹、大黃、黃柏、炒川楝子、蒲公英、炒槐花、野菊花抑菌效果為中度敏感。滅菌作用以訶子最強。魚腥草、黃連、板藍根、白茅根、苦參、金銀花、梔子、地錦草、千里光、榧子、使君子、柴胡、槐花、貫眾、大蒜、螺旋藻、刺五加、黃芪、杜仲葉、穿心連、黨參、刺五加、枸杞子、大蒜、甘草、地錦草、白頭翁、五倍子、茯苓、鉤藤、虎杖、柴胡、郁金等33種中藥對溶藻弧菌無抑菌效果（表1）。

2.2 不同復方二聯中藥對溶藻弧菌的體外抑制效果

在60 mg/mL的低藥物質量濃度時，復方中藥訶子+烏梅、黃芩+訶子、訶子+醋五味子、訶子+白芍、訶子+烏梅、烏梅+醋五味子、烏梅+白芍、黃芩+烏梅對溶藻弧菌的抑菌作用明顯，為極敏感。選擇協同增效的藥物組合可增強療效，二聯中藥的各味藥用量較一聯中藥少，抑菌效果增強，如烏梅與板藍根單味藥60 mg/mL時無藥效，但60 mg/mL二聯中藥有較強藥效。復方中藥黃連+訶子、黃柏+訶子、黃連+板藍根、板藍根+訶子抑菌為中度敏感。黃柏+黃連組成、黃連+醋五味子、黃柏+黃連、黃連+醋五味子、黃連+白芍、大黃+黃連、黃柏+板藍根、黃芩+黃連、黃柏+白芍等10種復方中藥無抑菌作用（表2），說明多種二聯中藥組合有拮抗作用，無藥效。藥物質量濃度為240 mg/mL時，以下14種復方雙聯中藥對溶藻弧菌的抑菌作用明顯，為極敏感（表3），藥效從高到低分別是（訶子+白芍）、（訶子+烏梅）、（白芍+醋五味子）等。黃連+醋五味子等3種復方中藥對溶藻弧菌的抑菌作用明顯，為高度敏感，抑菌圈直徑大于15 mm。槐花與大黃等六種復方中藥抑菌效果為中度敏感。黃柏+黃連、槐花+大黃、大黃+黃連、黃柏+板藍根、黃柏+白芍、黃芩+黃連、貫眾+白芍、黃芪+白芍、黃芪+大黃、槐花+黃柏等組成29個復方中藥無藥效（表2、3）。相對于一聯中藥，二聯中藥各組合物中，有起協同增效的藥物組合，也有起拮抗作用、降低藥效的藥物組合。

2.3 不同復方三聯中藥對溶藻弧菌的體外抑制效果

在60 mg/mL的低濃度藥物時，訶子+烏梅+蒲公英、黃芩+訶子+黃芪組成復方中藥等22種中藥抑菌效果極為敏感，抑菌圈直徑大于22 mm。黃連+訶子+黃芪、白芍+貫眾+大黃、白芍+醋五味子+大黃等組成復方中藥抑菌效果為高度敏感。大黃+梔子+白芍、大黃+黃芪+白芍等組成15種復方中藥抑菌效果為中度敏感。以下11種復方中藥無抑菌效果，包括黃連+醋五味子+黃芪、大黃+黃芪+白芍、黃連+白芍+黃柏、黃連+大黃+黃芪、黃連+連翹+黃芪等（表4）。

表1 240 mg/mL濃度單味中藥對溶藻弧菌的抑菌作用

說明：+ + +，極敏感；+ +，高度敏感；+，中度敏感。

表2 60 mg/mL濃度二聯中藥對溶藻弧菌的抑菌作用

說明：+ + +，極敏感；+ +，高度敏感；+，中度敏感。

表3 240 mg/mL濃度二聯中藥對溶藻弧菌的抑菌作用

說明：+ + +，極敏感；+ +，高度敏感；+，中度敏感。

藥物質量濃度在240 mg/mL時，以下24種復方中藥對溶藻弧菌的抑菌作用明顯，抑菌直徑大于20 mm，為極敏感，包括黃芩+訶子+黃芪、烏梅+醋五味子+黃連等。13種復方對溶藻弧菌的抑菌作用較明顯，為高度敏感，包括烏梅+板藍根+黃連、烏梅+黃芩+黃連等。12種復方中藥對溶藻弧菌的抑菌效果為中度敏感，分別為大黃+黃芪+白芍、黃柏+醋五味子+黃芪等（表5）。相對于一聯中藥、二聯中藥，抑菌作用強三聯中藥的復方總數增加較多，說明選擇起協同增效的藥物組合可增強療效。

表4 60 mg/mL濃度三聯中藥對溶藻弧菌的抑菌作用

續表4（Continued）

說明：，抑菌圈直徑Bacteriostatic circle diameter； + + +，極敏感；+ +，高度敏感；+，中度敏感。

表5 240mg/mL濃度三聯中藥對溶藻弧菌的抑菌作用

續表5（Continued）

說明：，抑菌圈直徑Bacteriostatic circle diameter； + + +，極敏感；+ +，高度敏感；+，中度敏感。

2.4 抗生素藥物敏感試驗

表6可見，溶藻弧菌對恩諾沙星、鹽酸多西環素、土霉素及甲氧芐啶/磺胺甲噁唑4種藥物高度敏感。對硫酸新霉素、氟苯尼考2種藥物中度敏感。對硫酸慶大霉素及磺胺嘧啶2 種藥物耐藥。

表6 溶藻弧菌對8種抗生素的藥物敏感性

說明：S：高度敏感；I：中度敏感；R：耐藥。

Note: S: Highly sensitive; I: Medium sensitivity; R: Resistant.

3 討論

3.1 單味中藥的抗菌作用

許多中藥有顯著的抗菌作用及廣譜的抗菌活性，并用以治療動物疾病。中藥免煎配方顆粒已得到較廣泛的運用，其抑菌效果好，可克服湯劑需要浸泡、煎煮、耗時、不易儲存、不易定量等缺點，有較多優勢[15-20]。同一種藥物顆粒劑與水煎劑對同種菌的抑菌圈大小差異較小[21]。使用中藥顆粒劑研究動物疾病防治還可避免研究人員的操作誤差。因此，本研究選用中藥顆粒劑進行溶藻弧菌體外抑菌試驗。

在抑菌試驗中，用改良的牛津杯法測定抑菌圈是測定藥物效價和活性的通用方法，本研究的49 種中藥對溶藻弧菌抑菌圈結果可靠：在中藥質量濃度為240 mg/mL時，訶子、烏梅、醋五味子對溶藻弧菌抑菌效果為極敏感，以訶子滅菌作用最強；白芍、艾葉、黃芩等對溶藻弧菌抑菌效果為高度敏感；黃連、金銀花、梔子、五倍子等33種中藥無抑菌效果。其他學者亦有相似結果：黃連、黃柏、黃芩對鮑曼不動桿菌（）、銅綠假單胞菌（）、屎腸球菌（）抑菌效果最好，五味子、黃連、烏梅、黃柏、艾葉4 種藥物對雞源多殺性巴氏桿菌（）、嗜水氣單胞菌（）有較強抑菌活性，黃芩、大黃、虎杖中藥對豬源金葡菌（）有良好的抑菌活性[22]。五倍子、大黃、虎杖和黃芩單味藥對養殖病鰻（）中的嗜水氣單胞菌均有較好的抑菌作用，以黃芩抑菌效果最佳，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant, MRSA）、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌（）、肺炎克雷伯菌（）、鮑曼不動桿菌有一定的抑菌效果[23]。連翹對銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌亦有一定的抑菌效果[23]。曲徑等[24]篩選出黃連、黃柏、艾葉對禽多殺性巴氏桿菌敏感。黃連、黃芩、連翹等對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌()、鏈球菌均有較強抑菌作用，黃芪等對金黃色葡萄球菌也有抑菌作用[25]，對于金黃色葡萄球菌，抑菌作用五味子＞黃芩＞黃連。實驗手段、條件、所試細菌毒力的強弱、藥物的采集部位、藥物處理等對實驗結果有一定影響。

3.2 中藥復方的抗菌作用

由于中藥復方由多種藥構成，化學成分多樣，合理的單味藥配伍組成復方可協同增效，抑菌效果比單味中藥更佳，可較好地治療復雜疾病[25]。本研究中，在60 mg/mL的低藥物濃度時，訶子+烏梅等組成8個復方二聯中藥對溶藻弧菌的抑菌效果為極敏感。訶子+烏梅+蒲公英等22種組成復方三聯中藥抑菌效果極為敏感。藥物質量濃度為240 mg/mL時，訶子+白芍等14種復方二聯中藥對溶藻弧菌的抑菌效果為極敏感。24種三聯中藥對溶藻弧菌的抑菌效果為極敏感。相對于一聯、二聯中藥，三聯中藥抑菌作用強的復方總數增加較多，說明選擇有協同增效作用的藥物組合能增強療效。本研究中，五倍子、訶子等藥物對溶藻弧菌有較強抑菌作用，與其他藥物組成與二聯復方、三聯復方的抑菌作用顯著增強，國內學者研究結果也表明復方中藥對細菌有抑制作用：五倍子、地錦草、大黃、烏梅、訶子等藥物對嗜水氣單胞菌有較強抑菌作用，其中五倍子抑菌效果最佳，藥效持久，為理想的抑菌藥物。五倍子分別與黃連、訶子、大黃組成復方滅菌活性較強，復方抑菌效果較單味藥有顯著增強作用，說明合理的藥物組合有協同增效作用。黃芩、黃連、訶子、大黃、五味子等對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、巴氏桿菌有較強滅菌作用，黨參、黃芪對金黃色葡萄球菌抑菌作用不強[25]，復方中藥不是每種單味藥有效成分的總和，而是不同藥物間有化學變化，產生新的物質，起協同增效作用[23]。單味中藥與復方中藥抑菌的有效成分、作用機理仍需進一步的深入研究。

3.3 抗生素對溶藻弧菌的抑制作用

為進一步進行抗生素與所篩選中藥的聯用研究，減少魚病防治中的抗生素用量，本研究進行8種抗生素對溶藻弧菌的體外抑菌試驗，以篩選對溶藻弧菌抑菌效果較好的抗生素。結果發現，溶藻弧菌對恩諾沙星、鹽酸多西環素、土霉素及甲氧芐啶/磺胺甲噁唑4種藥物高度敏感，對硫酸新霉素、氟苯尼考2種藥物中度敏感。

目前，尋找敏感的抗生素仍是生產實踐中溶藻弧菌病藥物防治的方法之一。本研究中藥與抗生素的體外抑菌研究結果可為有效治療細菌性疾病提供依據。在治療中使用抑菌效果好藥物，可達到減少使用劑量，為水產養殖業健康發展提供幫助。

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In Vitro Bacteriostasis of 49 Kinds of Chinese Herbs, Antibiotics and Their Compound Prescriptions Against

XU Xiao-jin1,2, LI Xiu-hua3, MA Yi-fan4, LI Hui-yao1,2, QI Xin1,2, CHEN Yu-nong1,2, Lü Hai-long1,2, YAN Qing-pi1,2

（1.,,361021,; 2...,350308,; 3.,361021,; 4.,,361005,）

To screen out the Chinese herbs, antibiotics and their compound antibacterial activity againstFifty Chinese herbs including,Pall, and, etc. were employed to test their antibacterial effect onandby using improvedtests. Then the herbs that had the optimal effect were chosen to compose as the combination compounds prescription to compare their antibacterial activity. The concentrations of Chinese medicines were 60, and 240 mg/mL, respectivelyEach experiment was repeated 3 times. 8 antibacterial drugs againstwere tested.and(Turcz.) Baill etc had obvious inhibitory effect. The concentrations of Chinese medicines were 60 mg/mL, and 8 compound prescriptions, such asandhad obvious inhibitory effect. Fourteen compound prescriptions, such asandPallhad obvious inhibitory effect at a concentration of 240 mg/mL. 24 compound prescriptions, such asandhad obvious inhibitory effect at a concentration of 60 mg/mL. Twenty two compound prescriptions, such as,andhad obvious inhibitory effect at a concentration of 240 mg/mL.were susceptible to enrofloxacin, oxytet racycline, oxytetracycline, and trimethoprim.Eighteen Chinese drugs had inhibitory effect, 2compound prescriptions such ashad obvious inhibitory effects. Traditional Chinese herbal medicine (TCHM) formulas and TCHMformulas combined with antibiotics could be used for preventing the diseases outbreak in.

quantitative Real-time PCR；reference gene；

S948；S941.42

A

1673-9159（2019）06-0030-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.06.005

2019-07-01

國家自然科學基金（31702384、31502194）；福建省科技重大專項（2016NZ0001-3）；2018年開放課題基金項目（LYC2018RS04，閩海鷗[2018]31號）；福建省自然基金項目（2018J01455）；2017年集美大學研究生教育教學改革研究項目（集大研No.［2017］18號）；教育部鰻魚工程研究中心開放基金項目（RE201704）

徐曉津（1969―），女，副教授，博士，研究方向為水產微生物學。E-mail: xiaojinxu@jmu.edu.cn

鄢慶枇（1971―），男，教授，博士生導師，研究方向為水產微生物學。E-mail: yanqp@jmu.edu.cn

徐曉津，李秀華，馬一帆，等. 49味中藥及其復方與抗生素對溶藻弧菌的體外抑菌作用[J]. 廣東海洋大學學報，2019，39（6）：30-38.

（責任編輯：劉慶穎）