具有新霉素抗性的小鼠胚胎成纖維細胞的分離及飼養(yǎng)層制備

摘 要 目的：建立一種操作簡便，并能高效獲得高質量的具有新霉素抗性（neo）的C57BL/6J小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblast cells， MEF細胞）的分離培養(yǎng)方法;所得細胞經過絲裂霉素C處理后能作為飼養(yǎng)層細胞支持小鼠胚胎干細胞（mouse embryonic stem cells， mESC）的生長和neo抗性篩選。方法：取12.5-14.5d的胎鼠軀干部剪碎成糊狀，利用Collagenase type IV和Trypsin的消化作用獲得原代MEF細胞。使用絲裂霉素C處理MEF細胞獲得飼養(yǎng)層細胞。結果：制備得到的MEF細胞形態(tài)飽滿、增殖速度快、細胞數量充足。使用絲裂霉素C處理細胞后，細胞正常存活但失去增殖能力，能支持mESC的生長和neo抗性篩選。結論：成功制備具有neo抗性的MEF細胞和飼養(yǎng)層細胞。

關鍵詞 新霉素 MEF細胞 mESC 絲裂霉素C 飼養(yǎng)層

中圖分類號：R329.2文獻標識碼：A

1材料與方法

1.1材料

眼用手術剪和鑷子各3把、15mL離心管（Nest）、35mm細胞培養(yǎng)皿（Nest）、凍存管（Thermo）、梯度降溫盒（Thermo）、臺式高速冷凍離心機（Thermo）、顯微鏡（Olympus）。

1.2試劑及溶液配制

DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25% Trypsin-EDTA、100譍lutaMAX Supplement、100譓EM Non-Essential Amino Acids Solution（NEAA）、FBS 、PBS、100姿埂？.22%em過濾器均購自Thermo Fisher Scientific;Collagenase type IV、絲裂霉素C、DMSO購自Sigma公司。

1.3溶液配制

（1）膠原酶消化液：根據該批次Collagenase type IV的酶活單位，取適量用DMEM/F12培養(yǎng)基溶解，配制成2000uint/mL，即10證ollagenase type IV，使用0.22%em過濾器除菌后備用。先吸取2.7mL的 DMEM/F12放置到15mL的離心管內，再加入300%eL 10證ollagenase type IV，混合均勻，即為膠原酶消化液。

（2）完全培養(yǎng)基：15% FBS+1譍lutaMAX Supplement+1譔EAA+1姿？82% DMEM/F12。

1.4實驗動物

SPF級的C57BL/6J-Tg（pPGKneobpA）/Nju小鼠購自南京大學模式動物中心，飼養(yǎng)于蘇州大學實驗動物中心SPF屏障系統。動物實驗操作嚴格遵守蘇州大學實驗動物倫理委員會的要求。

2方法

2.1原代MEF細胞制備

（1）12-16周齡的C57BL/6J-Tg（pPGKneobpA）/Nju雌雄小鼠按照2：1比例合籠配種，第二天早上觀察有無陰道栓以確定是否配種，如有則記為孕0.5d。

（2）孕12.5至14.5d時，頸椎脫臼法處死孕鼠，鼠體放于75%乙醇溶液中浸泡1min減滅體表細菌。

（3）剪除孕鼠腹部的毛發(fā)，然后剪開腹部皮膚及肌肉層，暴露子宮。更換一套手術器械，用鑷子提起子宮頸端并剪斷，分離子宮系膜并剪斷子宮角，取出整個子宮置于培養(yǎng)皿中，用PBS洗除子宮上的體液。

（4）更換手術器械，在超凈工作臺內剪開子宮，取出胎鼠，在含10姿溝腜BS中洗滌數次。去除胎鼠的頭尾、四肢及內臟團，僅保留軀干部，并用PBS漂洗去除軀干部的紅細胞及胎肝等。

（5）將軀干部轉移至35mm細胞培養(yǎng)皿中，將軀干部剪成小于1mm3的組織塊。然后加入3mL的膠原酶消化液，反復吹打混勻后，置于37℃，5%CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱內消化過夜。

（6）將上步消化后得到的細胞懸液吹打均勻，收集到15mL的離心管中，1000rpm/min離心5min，棄上清。向離心管中加入500%eL的Trypsin，37℃消化20min，然后加入1mL的完全培養(yǎng)液終止消化，并用槍頭吹打均勻。1000rpm/min離心5min，棄上清，加入5mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，并將細胞懸液轉移至35mm細胞培養(yǎng)皿中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2飼養(yǎng)層細胞制備

MEF細胞在培養(yǎng)皿中生長達到80-90%飽和度時，去除舊培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，加入含有10%eg/mL的絲裂霉素C的完全培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱中處理3小時。3小時后去除舊培養(yǎng)基，PBS洗1次，終止絲裂霉素C的處理。此時細胞即可作為mESC的飼養(yǎng)層使用。

3結果

光學顯微鏡下觀察，MEF細胞多呈梭形，形態(tài)飽滿，胞質透明（A圖）。使用絲裂霉素C處理MEF細胞后，向該培養(yǎng)皿中接種消化后的mESC，培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)過程中觀察到mESC克隆逐漸增大，克隆邊緣緊致、清晰，生長狀態(tài)良好，mESC仍保持未分化狀態(tài)（B圖）。

4討論

隨著生物醫(yī)學研究的日益發(fā)展，基因敲除小鼠作為最常用的動物模型在科學研究中起到重要作用。而目前，條件性基因敲除小鼠模型的制作還主要基于ES細胞打靶技術，此方法需要大量的MEF細胞作為飼養(yǎng)層來支持、穩(wěn)定mESC的生長和neo抗性篩選。因此，制備具有neo抗性的MEF細胞具有十分重要的作用。MEF細胞不僅可以作為mESC的飼養(yǎng)層，近年來又廣泛用于皮膚組織損傷修復研究;核移植和重編程研究;輻射損傷后的細胞遷移及凋亡研究等。

本研究使用C57BL/6J-Tg（pPGKneobpA）/Nju胎鼠作為MEF細胞的取材對象，以組織塊消化法建立了一種簡便經濟的成纖維細胞的分離培養(yǎng)方法。與傳統的組織塊培養(yǎng)法相比較，該方法具有成纖維細胞獲得數量多、生長狀態(tài)好、非實質性細胞污染少及細胞污染風險低等優(yōu)點。

參考文獻

[1] Thomas，K.R.&C.Deng&M.R.Capecchi.High-fidelity gene targeting in embryonic stem cells by using sequence replacement vectors[J]. Molecular & Cellular Biology，1992（12）： 23-2919.

[2] Park，Y.G.&S.E.Lee&E.Y.Kim，et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro[J].Dev. Reprod， 2015，19（03）： 119-126.

[3] Zhou，Y.&H.Mao&B.Joddar，et al. The significance of membrane fluidity of feeder cell-derived substrates for maintenance of iPS cell stemness[J]. Sci Rep， 2015，12（05）： 11386.

[4] Li，W.&A.Mukherjee&J.H.Wu，et al. Sperm Associated Antigen 6（SPAG6） Regulates Fibroblast Cell Growth， Morphology，Migration and Ciligenesis[J]. Sci Rep， 2015（05）： 16506.

[5] Mansoori-Moghadam，Z.&M.Totonchi&M.Hesaraki，et al. Programming of ES cells and? reprogramming of fibroblasts into renal lineage-like cells[J].Exp Cell Res，2019（379）： 225-234.

[6] Antunovic，M&I.Matic&B.Nagy，et al. FADD-deficient mouse embryonic fibroblasts undergo RIPK1-dependent apoptosis and autophagy after NB-UVB irradiation[J].J Photochem Photobiol B，2019（194）： 32-45.