外源ATP對羊肚菌采后理化性質和揮發性呈香物質的影響

劉維　周智威　白婷　劉保　張國建　李洋　孫群

摘要：探究外源ATP處理對羊肚菌采后理化性質和揮發性呈香物質的影響，為羊肚菌保鮮方法的探索提供理論基礎。新鮮羊肚菌用0.5mmol/L和0.7mmol/L ATP溶液浸泡處理后4℃貯藏，測定儲藏期間水分活度、細菌總數、PPO酶活、還原性糖含量、脂質氧化水平、揮發性呈香物質。與對照相比，0.5mmol/L ATP處理組在儲藏期間的水分活度和菌落總數降低，還原糖含量減少，脂質氧化程度降低。ATP處理可以提高羊肚菌關鍵揮發性呈香物質的含量，如2-甲基丁醛、苯乙醛、反-2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇、1，2-二甲基-3-辛酮。0.5mmol/L ATP處理可以較好地保持羊肚菌采后儲藏期間的生理特性和香味特征。

關鍵詞：羊肚菌;保鮮;三磷酸腺昔;脂質氧化;揮發性呈香物質

中圖分類號：TS255.3 文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2019）08-0085-08

0 引言

羊肚菌，隸屬子囊菌亞門、盤菌綱、盤菌目、羊肚菌科、羊肚菌屬，因其菌蓋表面呈褶皺網狀、狀如羊肚而得名，主要分布在我國四川、青海、西藏、新疆等地。羊肚菌的營養價值和保健功效，使其商業化發展具有廣泛的市場前景。近年來，羊肚菌全國人工種植規模劇增，從2012年的0.3萬畝發展至2017年7萬畝（1畝=666.67m²），年總產量接近2萬噸，在未來的兩三年內羊肚菌的鮮貨銷售量預計將達到每日15～20噸。

新鮮羊肚菌采收時表面堅挺，組織脆嫩，含水量高，表面沒有保護結構，一般為白色或灰褐色。采后呼吸作用和新陳代謝仍然持續，水解酶和氧化酶酶活力升高，呼吸作用劇烈，在采收和運輸過程中易受到機械損傷和微生物侵染，出現褐變、開傘、皺縮、軟化等品質劣變現象。新鮮羊肚菌對溫度極為敏感且具有特殊的中空結構，目前最常用的保鮮方法是4～10℃冷庫儲藏，貨架期也只能延長至3～5d;或者一20℃冷凍儲藏，貨架期可達到3個月以上，但是嚴重破壞羊肚菌的質構和風味。目前關于羊肚菌其他有效的保鮮技術的研究報道甚少。

能量平衡在食用菌采后成熟和衰老過程中非常重要。三磷酸腺昔（adenosine triphosphate，ATP）是一種不穩定的高能化合物，是生物體內最直接的能量來源。有研究報道，外源ATP應用于龍眼、荔枝和綠豆芽[1-3]等果蔬保鮮，提高采后果蔬所需能荷，避免果蔬呼吸消耗引起的能量匱缺，有利于保持較佳的感官品質。果蔬采后會產生一系列的應激反應，導致活性氧（reactive oxygen species，ROS）的積累，ROS的清除需要ATP供能，ATP的缺乏可能會造成ROS持續性積累，進而使細胞膜氧化損傷，破壞膜脂結構的完整性，加快果蔬的衰老過程。采后果蔬補給外源ATP可維持能量平衡，降低呼吸速率和有機物的消耗[1]。外源ATP也可作為信號分子，激活NO/Ca²⁺等第二信使，調節細胞壁多糖、果膠降解等相關基因的表達[3-4]，減緩采后果蔬的品質劣變速度。本文首次嘗試將外源ATP應用到羊肚菌保鮮研究中，探究ATP處理對羊肚菌理化性質和揮發性呈香物質的影響，為進一步摸索羊肚菌保鮮方法提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

人工種植梯棱羊肚菌Morchella importuna（購于四川省甘孜藏族自治州康定市）;PE保鮮袋（購于家樂福超市）;鄰苯二酚、三氯乙酸、沒食子酸、濃硫酸、硫酸亞鐵、二甲酚橙、BHT、F-C試劑、氯化鈉、過氧化氫、硫代巴比妥酸、三苯基膦（TPP），乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、甲醇、乙醇等試劑均為分析純（購于成都鵬世達實驗用品有限公司）。

1.2 儀器

DK-8數顯恒溫水浴鍋：上海躍進醫療器械有限公司;LabMaster neo控溫臺式水活度測定儀：瑞士NOVASINA公司;Micro2l R型高速冷凍離心機：美國Thermo Fisher Scientific公司：AFZ-1002-U型超純水儀：美國Aquapro公司UV-2450紫外分光光度計：日本Shimadzu公司;島津氣質聯用GC-MS QP2010：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 羊肚菌處理方法

羊肚菌采收后用泥土覆蓋和冰盒低溫保存送至實驗室，放在通風處讓表面水分自然風干，24h內處理樣品。挑選大小一致品相優良的羊肚菌隨機分成3組，分別用0.5mmol/L ATP溶液和0.7mmol/LATP溶液浸泡60s為處理組，純水浸泡60s為對照組，每組3個平行，PE保鮮袋包裝封口，4℃儲藏。第1，5，9天檢測指標。

1.3.2 質構測定

測定時將羊肚菌菌柄切成1cm×1cm的正方形樣品。質構儀測定模式：質地多面分析（textureprofile analysis，TPA）;TPA參數設置：測試速率2.0mm/s，返回速度為4.5mm/s，形變量85%，停隔時間5 s，數據收集頻率100Hz;探頭類型：p/10直徑10mm的圓柱形探頭;測定指標：硬度、粘性、彈性、內聚性、咀嚼性和回復性。每個處理重復3次，求平均值。

1.3.3 水分活度測定方法

室溫下將羊肚菌柄和菌蓋連接處切成小圓柱形，稱取2.0g。Lab Master neo控溫臺式水活度儀測定水分活度。

1.3.4 菌落計數

采用平板菌落計數法檢測羊肚菌儲藏過程中的菌落總數，方法參考GB 4789.2-2016（（食品微生物菌落總數的測定》。

1.3.5 多酚氧化酶活力測定方法

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力采用鄰苯二酚比色法測定[5]。取羊肚菌1.0g加入10mL預冷的pH6.80.05mol/L磷酸緩沖液（含1%PVPP），充分研磨，10000r/min離心10min，上清液備用。取試管A加入1.25mL pH6.8的磷酸緩沖液，在40℃溫浴10min，加入0.25mL 40℃預熱的樣液，立即加入0.25mL 20%的三氯乙酸溶液使酶失活，混勻，加入0.25mL 0.3mol/L鄰苯二酚，8000r/min離心5min，取上清，于波長410nm處測定溶液吸光度A₁，此為反應開始時的數值。同時，以磷酸緩沖溶液替代樣液做相同處理，為空白對照。試管B加入1.25mL pH6.8的磷酸緩沖液，0.25mL0.3mol/L鄰苯二酚，搖勻，在40℃溫浴10min，加入0.25 n止預熱的樣液的同時開始計時，3min后立即加入0.25mL 20%的三氯乙酸溶液，8000r/min離心5min，取上清，于波長410nm處測溶液的吸光度A₂，此為反應終止時的數值。其中A=A₂-A₁，以△A變化0.01為一個酶活力單位計算酶活。

1.3.6 還原糖含量測定方法

還原性糖含量測定采用3，5-二硝基水楊酸法[6]。取1.0g羊肚菌加入10mL預冷的pH 6.8 0.05mol/L磷酸緩沖液（含1% PVPP），充分研磨，80℃水浴30min使還原糖浸出，10000r/min離心10min，上清液備用。取0.5mL樣液，加入1.5mL3，5-二硝基水楊酸試劑，棍勻，沸水水浴5min，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，再以蒸餾水定容至10mL，混勻，于波長540nm處測定吸光度。以緩沖溶液替代樣液做相同處理，作為空白對照。以0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/mL葡萄糖溶液繪制標準曲線，根據標準曲線計算還原性糖含量。

1.3.7 脂質氧化水平檢測方法

過氧化脂質（lipid peroxide，LPO）測定采用FOX 2法[7]。取1.0g羊肚菌加入10mL預冷的80%乙醇水溶液（含0.01%BHT），充分研磨，10000r/min離心10min，上清液備用。取0.5mL樣液，分別加入0.1mL 10mmol/L TPP（+TPP）和甲醇（-TPP），渦旋振蕩1min，室溫孵育30min，最后加入1mLFOX反應液，室溫孵育30min，于波長560nm處吸光度值Abs560[+TPP]和Abs560[-TPP]，Abs560LOOH=Abs560[-TPP]-Abs560[+TPP]。以濃度為0，5，10，15，20，25μmol/L H₂O₂繪制標準曲線，根據標準曲線計算樣品LPO含量。

脂質氧化測定采用TBARS法[8]。取1.0g羊肚菌加入10mL預冷的TCA混合液（含7.5% TCA和0.1%EDTA-2Na），充分研磨，于55℃水浴30min，10000r/min離心10min，上清液備用。取1.0mL樣液，加入1.0mL 0.02mol/L硫代巴比妥酸溶液，混勻，于90℃水浴內反應20min。以TCA混合液為空白調零，于532nm波長處測定吸光值。

1.3.8 揮發性呈香物質檢測

頂空固相微萃取[9]條件：取2g樣品（切成2mm厚度的片狀）于20mL樣品瓶中密封，50℃平衡5min，SPME萃取頭頂空萃取40min，色譜條件：進樣口溫度為250℃，不分流進樣，解吸5min。載氣為高純氦氣，恒定流量1.0mL/min。采用程序升溫，初始溫度40℃，保持1min;然后以10℃/min的速度升至70℃，保持2min;以3℃/min的速度升至105℃，維持1min;最后以10℃/min的速度升至180℃，保持1min。質譜條件：接口溫度280℃，離子源溫度230℃，發射電流70A，掃描范圍50～550m/z，

2 結果與分析

2.1 羊肚菌外觀變化

圖1是羊肚菌在儲藏過程中的外觀變化。由圖可知羊肚菌在儲藏過程中會發生不同程度的褐變，菌柄從白色逐漸變黃，0.7mmol/L ATP處理組的褐變現象最為明顯。第9天，對照組和0.7mmol/LATP處理組表面可以觀察到少量白色菌絲，失去食用價值;在第11天，對照組和0.7mmol/L ATP處理組表面的白色菌絲生長明顯，0.5mmol/L ATP處理組的表面有少量白色菌絲開始生長。從表觀結果來看，0.5mmol/L ATP可以延緩羊肚菌表面菌絲的生長。

2.2 羊肚菌質構變化

質地是羊肚菌在儲藏過程中品質評價的重要指標。TPA是模擬人口腔咀嚼的過程，可以從硬度、內聚力、咀嚼性和彈性反應羊肚菌的質構特征。羊肚菌采后的新陳代謝仍在進行，蛋白、果膠和纖維素等細胞壁成分不斷降解，水分因呼吸作用而消耗，導致細胞膨壓降低，細胞結構松弛疏散，羊肚菌硬度、咀嚼性和彈性就會隨之降低[10]。

表1列出了不同處理的羊肚菌在不同儲藏時間硬度、咀嚼性和彈性的變化。結果顯示，對照組的硬度和咀嚼性在整個儲藏期間呈先降低后增加的趨勢，而ATP處理組則是先增加后略微降低的趨勢，該結果與杏鮑菇的品質變化趨勢相似[11]。對照組和處理組羊肚菌的彈性在整個儲藏期均沒有發生顯著性變化（P>0.05），可能是因為羊肚菌本身的彈性較小，相應的變化也不明顯。對照組第5天的硬度與初始相比顯著降低（P<0.05），可能是羊肚菌采后細胞內營養物質消耗，導致細胞結構強度降低，第9天對照組的硬度咀嚼性又增加是因為在儲藏后期羊肚菌失水過多，子實體表面皺縮變硬。ATP處理組在第5天的硬度和咀嚼性顯著高于對照組（P<0.05），第9天僅有輕微降低，可能是外源ATP為采后羊肚菌提供新陳代謝所需的能量，避免子實體蛋白等營養物質的降解，同時還能促進果膠和纖維素的形成，從而維持羊肚菌正常的形態結構。其中，0.5mmol/L ATP比0.7mmol/L ATP更能提高羊肚菌的硬度和咀嚼性。總體來看，0.5mmol/L ATP處理可以很好地維持羊肚菌質地特征。

2.3 外源ATP對羊肚菌水分活度的影響

水分活度A_W值在食品保鮮研究中具有重要意義，可以用來預估和衡量食品中腐敗微生物的繁殖、代謝、抗性及生存等能力，較低的水分活度可以提高食品的穩定性和防腐能力[12]。圖2是羊肚菌在儲存過程中的水分活度變化趨勢。由于羊肚菌本身屬于高水分食品（Aw_W=0.9～1.0），在儲藏期水分活度的變化較小。在儲藏末期ATP處理組的水分活度都顯著低于對照組（P<0.05），而0.5mmol/LATP處理組和0.7mmol/L ATP處理組之間沒有顯著差異（P>0.05）。結果表明外源ATP處理可以顯著抑制羊肚菌自由水含量的升高，在儲藏過程中對微生物侵染羊肚菌有一定的抑制作用。

2.4 外源ATP對羊肚菌微生物生長的影響

食用菌采后容易受到微生物侵染而腐敗變質，微生物生長量是評價羊肚菌耐儲性的重要指標。圖3是儲藏過程中對照組和處理組的微生物生長量變化趨勢。儲藏過程中，對照組和處理組在第。一5天菌落總數顯著增加（P< 0.05），第5天和第9天，0.5mmol/L ATP處理組的菌落總數都顯著低于對照組（P<0.05），0.7mmol/L ATP處理組的菌落總數與對照相無顯著差異（P>0.05），表明 0.5mmol/LATP處理可以抑制羊肚菌表面微生物的生長。

ATP處理可以進一步提高了羊肚菌關鍵揮發性呈香物質的含量且無劑量差異，如2-甲基丁醛、苯乙醛、反-2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇、1，2-二甲基-3-辛酮，目前還未見相關報道，猜想可能是因為ATP處理可以使羊肚菌在一段時間內正常生長并成熟，使羊肚菌的香氣可以更加濃郁，具體的機制還有待研究。不過在其他食用菌保鮮研究中也有類似的報道，Clllere4[20]利用輻照對塊菌進行保鮮處理，發現1.5K電子束輻照可以提高3-甲基丁醇等塊菌特征香氣物質的含量，還發現電子束輻照比γ射線對塊菌香氣的影響更大，且表現為積極的影響。此外，研究報道ATP處理都能顯著緩解龍眼和綠豆芽[1，3]的褐變現象，但對羊肚菌的褐變并沒有表現出明顯的抑制效果。

4 結束語

0.5mmol/L ATP可以緩解羊肚菌的脂質氧化程度，很好地保持羊肚菌采后儲藏過程中的理化性質和香味特征，在羊肚菌保鮮研究中具有一定的應用潛力。褐變是影響食用菌品質的主要原因，是食用菌保鮮的重要指標，0.5mmol/L ATP在本文結果中不能有效緩解羊肚菌褐變現象。因此，在后期研究中有必要嘗試用其他方法聯用，以期摸索出一種安全、有效、方便的羊肚菌保鮮方法，拓寬羊肚菌的銷路，促進其商業發展。

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（編輯：莫婕）