茶多酚對草魚肝臟和腸道影響的顯微超微觀察

(安徽農業大學動物科技學院，安徽 合肥 230036) (安徽省合肥市第一中學，安徽 合肥 230601) (安徽農業大學動物科技學院，安徽 合肥 230036)

我國是茶葉生產大國，茶園種植面積達284.9萬公頃[1]，茶樹修剪產生的枝葉、茶葉加工產生的茶碎梗葉、大量夏秋茶等都可以用來提取茶多酚[2, 3]。TPs(tea polyphenols)是茶葉中多酚類物質總稱，占其干重的20%～30%[4]，適量的TPs可顯著促進魚類的生長，這可能與TPs促進魚類代謝以及增強消化吸收能力有關[5, 6]。TPs可以降低魚類肝臟脂肪代謝相關基因的表達，提高魚類肝臟抗氧化能力[5, 7]；適量的TPs可顯著提高青魚(Mylopharyngodonpiceus)腸道脂肪酶和蛋白酶活力[6]。TPs對動物肝臟與腸道的結構存在某些影響，例如TPs可使營養型肥胖大鼠肝細胞體積增大，減小肝血竇間隙[8]，TPs還能夠提高肉鴨回腸絨毛高度，增加回腸絨毛表面積[9]。但目前缺乏TPs對魚類影響的相關研究。為此，筆者以TPs飼喂草魚，并對其肝臟和腸道進行顯微和超微觀察，探討了TPs對魚類肝臟和腸道微觀結構的影響，以為新型飼料添加劑的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗魚購自合肥市大興鎮漁場，購回后采用1%濃度食鹽水消毒7～8min，暫養2周。暫養期間，每天飽食投喂對照組飼料2次。TPs購自蕪湖天遠科技開發有限責任公司，純度為98.37%。

1.2 試驗方法

試驗采用室內循環水養殖系統。該系統由單個體積為60cm×60cm×60cm(有效水體180L)的塑料水族箱與過濾池組成。養殖用水為曝氣自來水，水溫(28±1.0) ℃，日光燈8：00～20：00照明。

前期試驗中以0.00%～0.40%范圍的TPs投喂草魚，其中0.05% TPs組轉化效率顯著高于其他各組，其他各組之間無顯著差異，因此取無添加對照組、添加量最高的0.40%組以及生長效果最好的0.05%組進行比較，分別配制3種飼料。基礎飼料(對照組)粗蛋白含量為35.7g/100g(蛋白質主要來源為豆粕等植物蛋白)，能值15.13J/mg。飼料為粒徑2mm的顆粒飼料，65℃烘干，-20℃冰柜保存。

試驗開始前饑餓草魚24h，每箱隨機稱取30尾放入，每種處理3個平行。初始平均體重為4.50g。每天上午9：00和下午3：00過量投喂飼料1次，1h后回收殘餌。

8周后結束生長試驗，饑餓24h后稱量各組體重，每組取3尾試驗魚，第一脊椎處剪斷處死，取肝臟和前腸。同一樣本分2份，1份用作顯微切片，另1份用作電鏡切片。

1.3 顯微切片制作與觀察

新鮮肝臟和前腸切小塊，投入Bouin氏固定液固定24h，70%酒精溶液浸洗，經梯度酒精脫水，再浸在二甲苯中至透明，用石蠟透蠟和包埋，切片機切片(厚度為6μm)，經展片和烘片后，進行蘇木精-伊紅染色(HE染色)，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 電鏡切片制作與觀察

新鮮肝臟和前腸切修成小于1mm3的小塊，2.5%戊二醛固定2h，0.1mol/L磷酸緩沖液漂洗，1%鋨酸固定3h，0.1mol/L磷酸緩沖液漂洗，梯度酒精脫水，Epon 812樹脂包埋，超薄切片機切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，采用日立HT7700型透射電子顯微鏡觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 TPs對草魚肝臟結構的影響

3組草魚的肝臟顯微結構如圖1所示。可見各組肝細胞細胞核明顯，細胞界限明顯，但對照組肝血竇間隙最寬(圖1(a))，0.05%組肝血竇間隙最窄(圖1(b))，0.40%組有寬的肝血竇出現。

注：H為肝細胞；N為細胞核；RC為紅細胞；HS為肝血竇圖1 TPs對草魚肝細胞顯微結構影響

3組草魚肝細胞超微結構如圖2所示。可見各組肝細胞膜明顯，細胞核近似橢球形，線粒體成棒狀或球形并貼近細胞核周圍的粗面內質網，細胞質中可見數個脂肪滴。但對照組與0.40%組肝細胞胞質中脂肪滴數量多體積大(圖2(a)和(c))，細胞核偏離細胞中央位置，貼近細胞膜；0.05%組肝細胞細胞質的脂肪滴體積明顯變小(圖2(b))，細胞核略偏離中央位置。

2.2 TPs對草魚腸道結構的影響

3組草魚腸道黏膜層顯微結構如圖3所示。可見各組腸黏膜上皮細胞排列整齊，紋狀緣發達。與對照組相比，2個TPs組固有膜中血管更為豐富，黏膜層上皮內杯狀細胞更多，0.40%組的杯狀細胞最多。

注：Sb為紋狀緣；Ep為上皮細胞；GC為杯狀細胞；Pr為固有膜圖3 TPs對草魚腸道黏膜層顯微結構影響

3組草魚腸道黏膜層上皮吸收細胞游離面超微結構如圖4所示。可見各組微絨毛均勻緊密地分布，靠近微絨毛端的細胞質中有線粒體分布。2個TPs組的線粒體數量明顯多于對照組，其中0.05%組最多，分布最密集。

注：Mi為線粒體；Mic為微絨毛圖4 TPs對草魚腸道吸收細胞游離面超微結構影響

3 討論

研究表明，TPs可減輕營養型肥胖大鼠肝臟脂肪變性，縮小肝血竇間隙[8]。研究中，添加TPs可使草魚肝細胞排列緊密，肝血竇間隙縮小，與上述研究結果相似。但也有研究顯示，草魚肝臟出現損傷時，肝血竇間隙增大[10, 11]，這表明TPs可能對肝臟有一定保護作用。

已有研究顯示，適量TPs可降低魚類肝臟中脂肪相關合成基因的表達，減少肝臟中脂肪沉積[5, 12]。筆者研究則直觀地顯示0.05% TPs可明顯減小肝細胞中脂肪滴體積，明顯減少肝細胞中脂肪含量。對犬肝細胞的超微觀察顯示，TPs也減少了肝細胞中脂肪滴含量[13]。此外，研究中對照組和0.40%組肝細胞的細胞核貼近細胞膜，而0.05%組的細胞核偏移程度較小，這應該與前兩組細胞質中脂肪滴數量多體積大有關，營養性脂肪肝細胞的胞質中充滿脂肪滴，細胞核就會被脂肪滴擠偏移位[14]。這些研究表明，TPs確實有降低肝臟脂肪含量的作用，但不同劑量效果不同。用TPs飼喂大黃魚(Larimichthyscrocea)，0.02%的劑量對肝臟的降脂作用最為顯著[12]。0.05%組的降脂效果強于0.40%組，可以大體推測，TPs降低肝臟脂肪需要較低的劑量即可。

魚類腸道黏膜層最上層為上皮層，該層含有吸收細胞和杯狀細胞，吸收細胞游離面具有明顯的紋狀緣(電鏡下的微絨毛)，可增加腸表面吸收面積[15]；吸收細胞本身消化功能旺盛，胞質內存在線粒體以提供能量[16]；杯狀細胞則主要產生黏蛋白，該蛋白有潤滑、保護、免疫防御、消化和吸收等多種功能[17]；同時，黏膜層的固有膜中有毛細血管輸送營養物質[15, 18]。TPs對微絨毛高度及密度無明顯影響，但明顯增加了吸收細胞中線粒體數量以及杯狀細胞數量，TPs也使固有膜中的毛細血管變得更為豐富，其中0.05%組表現更為明顯，這些都表明TPs能夠影響腸道黏膜層的一些形態結構，從而提高腸道的消化吸收能力。