柚子皮黃酮提取與抗氧化性能研究

楊 尉

(浙江大學衢州研究院，浙江 衢州 324000)

黃酮類物質是良好的天然低毒抗氧化劑，不僅對羥基有顯著的清理作用，還能夠降低血液的黏稠度，減少血栓的形成等，具有極高的藥用價值[1]。我國每年的柚子產量幾百萬噸，而其中柚子皮就約占整個柚子重量的20%～30%，柚子皮往往會被視為垃圾丟棄掉，浪費了隱藏在其中的營養和藥用價值資源。柚子皮中含有的豐富黃酮類化合物，通過對柚子皮資源進行合理的開發利用和深加工，能創造較好的經濟效益和社會價值[2]。與其他純化方法相比較，大孔樹脂吸附法工藝在富集有效成分、減少雜質、設備便宜、成本較低、使用率較高等方面都顯示出其獨特性和優越性,使用大孔吸附樹脂分離純化黃酮在中藥產品的研發和產業化生產等領域具有十分寬廣的前景[3]。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

實驗儀器見表1。

表1 實驗儀器

1.2 實驗內容

1.2.1 原料的配制

將市售的柚子果皮剪成細小塊狀放入烘箱中，在溫度為60±1℃的烘箱下烘十八至二十個小時，烘干后將柚子皮取出用粉碎機粉碎成過60目篩，得到柚子皮粉末，密封保存備用[4]。

1.2.2 主要試劑的配制

(1) DNS試劑的配制：按照文獻[5]配置，在棕色瓶中存放7天后使用。

( 2)豬油準備：市場現購的新鮮肥豬肉切碎 ，用中火將肥肉熬制到呈金黃色，冷卻待用。

(3)硫代硫酸鈉標準溶液的配制和標定，按照文獻[6]進行。

(4) 蘆丁標準液：以蘆丁為總酮標準物， 配制蘆丁標準液[7]并繪制標準曲線。

1.2.3 柚子皮中黃酮類物質的提取和濃度測定

利用浸提加攪拌提取法，準確稱取5.0 g的柚子皮粉末，用70%的乙醇溶液，按20：1在50 ℃恒溫提取3h，抽濾得到黃酮類物質的濾液，轉移至100 mL的容量瓶中，再用70%的乙醇溶液定容到刻度線，得到黃酮母液(粗提物)待用。采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測量黃酮類物質的含量。量取適量的粗黃酮提取液至5 mL的比色管中，以蘆丁為總酮標準，設置空白對照。

1.2.4 大孔吸附樹脂吸附率和解吸附率的測定方法

準確稱取大孔吸附樹脂1.00 g于塞口錐形瓶中，加入20 mL黃酮母液，于搖床低速振蕩24小時后，收集吸附殘夜，并按照公式(1)計算出大孔吸附樹脂在室溫下(25℃)的吸附率。

吸附率E(%)=(c1-c2)/c1×100

(1)

式(1)中:c1為吸附前黃酮粗溶液濃度/(μg/mL)；c2為吸附后濾液中黃酮濃度/( μg/mL)[25]。

將上述中的吸附飽和樹脂，放于50 mL的具塞磨口錐形瓶中，加入20 mL 的70%乙醇溶液，隨后放在搖床上振蕩解吸附24小時，然后取適量濾液，測定濾液中黃酮的濃度，按公式(2)和(3)計算解吸附量與吸附率：

W/(μg/g)=( c1-c2)×V/m樹脂

(2)

解吸率(%)=cV'/W×100

(3)

(2)式中W為黃酮的飽和吸附量/(μg/g)，c1c2分別為吸附前后黃酮濃度/(μg/mL),V為黃酮溶液體積/mL； m樹脂為樹脂質量(g)。(3)式中：c為解吸液中的黃酮濃度/(μg/mL)； V'為洗脫液體積(mL)。

1.2.5 柚子皮黃酮類物質抗氧化性質研究

取10.00 mL 分離純化后的黃酮溶液，對照品為70%乙醇溶液。調節pH值為5，并在55 ℃條件下保溫一小時后加入20 g的豬油，且置于40℃條件下保溫，每隔24小時就測一次豬油的過氧化值(POV)。測定方法采用國標GB5009.5-2003推薦的碘量法。

POV=(V樣-V空)*M*100/W油

(4)

式中:POV為過氧化值(meq/kg)；M為Na2S2O3摩爾濃度；V 樣為樣品用量(mL)； V 空為空白樣品用量(mL)；W油為油的質量(g)。

2 實驗結果與討論

2.1 蘆丁標準曲線

圖1 蘆丁標準曲線圖

吸光度A與蘆丁質量濃度c( μg/mL)的標準曲線和線性回歸方程如圖1所示：y=0.0144x-0.029，其相關系數R2=0．9998，有良好的線性關系。

2.2 不同樹脂的靜態吸附性能

表2 不同樹脂的性能參數

測定三種大孔吸附樹脂對柚子皮黃酮類物質的吸附率和解吸率，其結果如表3所示。

從表3中可以看出三種樹脂各項指標都不錯，黃酮類化合物因多酚結構和糖苷鏈使其顯弱極性，X-5樹脂是非極性樹脂對黃酮類化合物的選擇性吸附不強，AB-8樹脂和DM-301樹脂從極性上分析都可以用來吸附黃酮， DM-301樹脂的孔徑和孔容都優于AB-8樹脂，實驗證明DM-301比其他兩種樹脂更適合于柚子皮黃酮類物質的分離純化[8]。

表3 大孔吸附樹脂對柚子皮黃酮類 物質的靜態吸附解吸測定結果

2.3 大孔吸附樹脂DM-301的靜態吸附等溫曲線

利用粗提的黃酮原液配置一系列不同濃度的黃酮溶液，分別各準確量取適量溶液加入放有1 g預處理好樹脂的磨口錐形瓶中，在室溫的條件下靜態吸附3h，然后分別移取適量的殘夜測量吸光度，并計算出樹脂的飽和吸附量。實驗結果如圖2所示。

圖2 孔吸附樹脂DM-301的靜態吸附等溫曲線

整體的趨勢是樹脂的吸附量隨著黃酮溶液濃度的增大而增大，當濃度到達195.14 μg/mL的時候，樹脂就基本達到了吸附飽和狀態。

2.4 洗脫液及洗脫液洗脫體積分數對大孔吸附樹脂的影響

分別用20 mL的30%，50%，70%，99.7%的乙醇溶液進行振搖洗脫，收集洗脫液，測量不同濃度乙醇下的洗脫液吸光度，計算出解析率，結果如圖3所示。

圖3 乙醇溶液洗脫體積分數對大孔樹脂的影響

由圖3可以看出，4種體積分數不同的乙醇溶液對大孔樹脂的解吸附率不同，這是由于被分離物質與樹脂之間的吸附力的強弱不同造成的[29]，根據“相似相溶”的原理，黃酮化合物為弱極性，在4種洗脫體積分數中乙醇濃度越高極性越低，99.7%的乙醇溶液極性最小，因此洗脫效果最佳。

2.5 動態吸附實驗

分別準確量10.0，12.0 ，14.0 ，16.0 ，18.0 ，20.0 ，22.0 ，24.0 mL粗提的黃酮類物質置于25 mL的容量瓶中，再以70%的乙醇溶液定容到刻度線。各量取適量配制的黃酮溶液加到裝有大孔樹脂的層析柱中吸附，然后進行動態吸附，以2 mL/min的流速流出，收集流出液，取適量的流出液測量吸光度，計算出樹脂的飽和吸附量，篩選出最佳的動態吸附濃度。

圖4 上樣濃度對吸附量的影響

由圖4可知，當黃酮濃度為214.65 μg/mL時，DM-301樹脂的吸附濃度最大，當超過214.65 μg/mL時，其吸附量就開始不再增加反而有下降的趨勢，一般來說濃度越高吸附量就越大，但若超過了樹脂的吸附極限，即飽和吸附量，則濃度過高就會解析，所以用DM-301大孔吸附樹脂分離純化柚子皮黃酮時黃酮濃度選214.65 μg/mL為最佳。

2.6 柚子皮黃酮類物質的抗氧化性研究

圖5 抗氧化穩定性對比

由圖5可得，隨著時間的延長，油脂被氧化就越明顯，且從圖5中可知柚子皮黃酮能夠改善油脂的氧化，使油脂的耐氧化得到了提高。