金烏賊精子釋放及精子活力的研究?

張東雪， 張秀梅, 2??， 李文濤， 李江濤

(1.海水養殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)，山東 青島 266003；2.青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266072)

金烏賊(Sepiaesculenta)，俗稱烏魚、墨魚，隸屬軟體動物門(Mollusca)頭足綱(Cephalopoda)烏賊目(Sepioidea)烏賊科(Sepiidae)烏賊屬(Sepia)，廣泛分布于中國黃渤海、東海、南海，日本北海道以南，朝鮮西南海域及菲律賓群島海域，是重要的經濟種[1]。繁殖期的雌性金烏賊常發生多次交配行為，雄性金烏賊為提高自身繁殖成功率，在交配前會機械性移除雌性口頰膜處先交配雄性的精莢，從而使自己的精莢完整地粘附于雌性口膜處。目前關于金烏賊精莢的研究多集中于精子超微結構和低溫損傷的電鏡觀察、精莢器的結構以及精莢的形成等。金烏賊精子為鞭毛型精子，分為頭部、中部和尾部三部分，外部附有光滑呈裙邊狀的被膜。精子由輸精管進入黏液腺后，輸精管壺腹收縮，使得每次進入的批量精子恰好形成一個精莢。精莢為長橢圓型，外部包有被膜，被膜內部包裹著三部分：彈射裝置、接合部和精團。當頭中部包裹的質膜破損，含有大量精子的精團則被釋放[2-3]。研究發現，中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)的精莢在進入納精囊后立即破裂，以游離精子的形式存在，副性腺自溶物蛋白中的小泡蛋白能夠促進精莢破裂[4]。但迄今關于影響金烏賊精子儲存、釋放的主導因素尚未見報道。

青島近海金烏賊繁殖期在每年5—7月，成體在沿岸產卵場結群并繁衍后代。觀察發現，5—7月隨著繁殖期的推移，海水溫度逐漸升高，雌性金烏賊產卵量減少，受精率逐漸降低[5]。因此推測，溫度亦可能是影響金烏賊精子活力和精莢中精子釋放的重要因素，其具體影響機制仍有待進一步研究。

針對上述問題，本文分別研究了促進金烏賊精子釋放的影響因素以及溫度對精子活力的影響，以期解釋金烏賊精子儲存與釋放機制，明確不同存放條件下精子的壽命與活力，為豐富金烏賊繁殖生物學研究內容，優化人工繁育技術提供參考資料和理論基礎。

1 實驗方法

1.1 金烏賊精子釋放的影響因素

選取狀態良好(色澤鮮亮、活力強、胴背部無傷)的親本10尾(5♀，5♂)，解剖雌雄親本，將精莢從精莢囊中剝離出來，暫置于冰上干凈的培養皿中。取精莢囊、副性腺、精巢、卵巢、纏卵腺組織塊各0.7～1 g，在液氮中研磨后，與海水1∶1混合。10 000 r/s冷凍離心15 min，取上清液即各組織的蛋白提取液。利用考馬斯亮藍法測定并統一蛋白濃度，將各組織蛋白提取液濃度統一調至3.87 g/L。各取2 mL人工海水、精莢囊蛋白液，副性腺蛋白液，精巢蛋白液、卵巢蛋白液、纏卵腺蛋白液于培養皿中，并在每個培養皿中分別放入10個剛摘取的新鮮精莢，其中人工海水為對照組，每組設置3個重復。實驗溫度維持在19 ℃，每隔30 min觀察并記錄完整精莢數量。

19和4℃條件下，另取30個新鮮精莢分別置于海水、副性腺蛋白液、精莢囊蛋白液、精巢蛋白液及纏卵腺蛋白液培養皿中，每7天更換一次上述液體，每天19：00記錄各組培養皿中精莢的完整情況，并隨機刺破1個完整精莢以檢測精子活力。

1.2 溫度對精子活力的影響

青島近海金烏賊繁殖初期的海水溫度約為19 ℃，此時繁殖狀態良好，隨著繁殖期的推移，水溫逐漸升高，后期繁殖力明顯下降。因此本實驗設置對照組19 ℃，5個溫度處理組20、21、22、23和24 ℃，比較分析不同溫度下金烏賊精子活力的差異，每個溫度設置3次重復。主要測定指標為精子激烈運動、慢速運動及原地顫動的持續時間，以鏡檢視野中70%左右精子由前一運動階段轉入后一運動階段時，認為該批精子已進入下一運動階段。統計精子壽命，即從精液與激活液混合開始，到鏡檢視野中約90%的精子停止活動為止的時間，即停止原地顫動。統計分析不同溫度條件下精子活力的差異，并對1個精莢中精子的數量進行計數。

2 結果

2.1 精子釋放速度與精子活性

各實驗組完整精莢的保持數量如表1所示。精莢離體1 h后，所有實驗組均保持完整形態。在卵巢蛋白組，完整精莢的數量隨時間的延長急劇下降。添加卵巢蛋白液后第5小時精莢頭部的質膜破損，精子開始釋放，第8小時，完整精莢剩余(8.00±0.00)個，第8.5小時，完整精莢僅剩余(4.00±0.58)個，第9小時，減至(3.33±0.33)個，第9.5小時，無完整精莢，精子全部釋放。由此說明卵巢蛋白提取液對金烏賊精莢中精子釋放具有明顯的促進作用。

在1.5和4 h時，精巢蛋白組的完整精莢分別為(9.00±0.00)和(8.00±0.58)個。第6小時，副性腺蛋白組的精莢剩余(9.33±0.33)個。由此可知，與卵巢蛋白提取液相比，副性腺蛋白、精莢囊蛋白、精巢蛋白和纏卵腺蛋白提取液對精子釋放的促進作用均較弱。

持續觀察發現，當水溫維持在19～20 ℃，海水中保存的精莢可連續4 d維持完整形態，而副性腺與精莢囊蛋白液中的精莢僅完整保存2 d，纏卵腺蛋白液中的精莢僅完整保存1 d，期間如使用針刺破精莢，則精子團立即釋放。但觀察發現，精莢在上述各蛋白液及海水中儲存到第2天時，針刺釋放出的精子已全部死亡(見表2)。

水溫4 ℃條件下，海水中的精莢可保持完整形態25 d，針刺后鏡檢發現，4 ℃存放3 d后，精莢形態雖完好，但僅有部分精子具活力，且精子處于運動狀態的時間為30 min～1 h，存放22 d后，精莢形態雖完整，但精莢內的精子全部失去活力。副性腺與精莢囊蛋白液中的精莢可維持完整形態3 d，精子僅在第1天具活性。而精莢在精巢與纏卵腺蛋白液中可保持完整形態2 d，精莢內的精子在第2天全部死亡(見表2)。綜上所述，較低溫度下，海水中保存的精莢，其完整形態和部分精子活力可維持較長時間。

2.2 精子最適溫度范圍

一個精莢中精子數量約1.99×107個。隨著水溫升高，不同溫度下精子激烈運動時間呈先升高后降低的趨勢。當精子處于20、21和22 ℃的海水中時，其激烈運動時間分別為(93.33±13.33)、(116.67±6.67)和(93.33±6.67)min，差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于19℃組的(43.33±12.02)min(P<0.05)。21 ℃組精子激烈運動時間顯著高于23 ℃組的(75.00±5.00)min和24 ℃組的(70.00±5.77)min(P<0.05)。不同溫度組中精子慢速運動時間差異不顯著(P>0.05)。隨水溫升高，精子原地顫動時間同樣呈現先升高后降低的趨勢。22℃組((80.00±10.00)min)精子原地顫動時間達到最大值，且顯著高于19 ℃組(46.67±8.82)min、20 ℃組的(50.00±11.55)min和21 ℃組的(53.33±3.33)min(P<0.05)，并高于23℃組的(75.00±5.00) min和24 ℃組的(60.00±5.77) min，但差異不顯著(P>0.05)。精子壽命在21℃時達到最大值(206.67±6.67) min，隨溫度升高又逐漸降低(見圖1)。

溫度對精子激烈運動時間的影響如圖2所示，通過擬合精子激烈運動時間y和溫度x的關系曲線，得出y=-6.225 14x2+267.507 05x-2 773.362,r2=0.370 89。當x=21.49℃時，ymax21.49=100.47 min。90%置信區間內，精子最長激烈運動時間的溫度范圍為20.22～22.76 ℃。因此判斷，水溫20.22～22.76 ℃時精子活力最高。

表1 各實驗組完整精莢的保持數量Table 1 The total number of spermatophore in each experimental groups

注：同列不同字母表示差異達到0.05的顯著水平(單因素方差分析ANOVA和Duncan多重比較)；表中數值為平均值±標準誤；n=3。F：組間均方/組內均方。P：檢驗水平。

Note: Different letters in the same column represent significant differences between different modes of locomotion (one-way ANOVA and Duncan’s multiple comparison tests,P<0.05); means ±standard error;n=3.F：Mean squares between groups/Mean squares within groups.P: Test level.

表2 不同溫度下各實驗組完整精莢及精子活性的保持時間Table 2 Life span of spermatophore and sperm in experimental groups at two different temperature

注：表中數值(A/B)為精莢保持完整形態時間/精子活性持續時間。

Note: A/B stands for the time of maintaining integrated spermatophores/the time of sperm motility.

圖1 溫度對金烏賊精子活力的影響Fig.1 Effects of temperature on sperm motility of S.esculenta

圖2 不同溫度對精子激烈運動時間的影響Fig.2 Effects of temperature on acute movement time

3 討論

溫度是影響生物生長和繁殖的重要因素。溫度過高或過低會影響生物體內生化反應相關酶的活性，進而影響機體健康狀態。溫度脅迫是物種進化的動力之一，長期的溫度變化可引起物種的分化甚至新物種的形成[6]。生物在對高溫的適應過程中，逐漸改變機體代謝水平和生理狀態，這更是一種積極的適應和調節過程[7]。本研究發現， 4和19 ℃時，海水中精莢維持完整形態的時間(25和4 d)遠大于其他實驗組(2～3 d，1～2 d)。但用針刺破精莢，鏡檢發現，4 ℃海水保存3 d后，仍有部分精子具活性，精莢持續保存22 d后，精子才完全失去活性，而其他實驗組的精子活性僅維持1 d。由此推斷，低溫海水環境能明顯抑制精莢頭部破損速度，對精莢外膜的損傷較小，同時低溫也抑制了精子的能量代謝，延長了精子壽命。有研究表明，當精子由常溫快速降至0 ℃時，由于冷休克，精子將發生不可逆的損傷，進而活力降低，而該溫度對精子的損傷要低于冷凍[8-9]。將金烏賊精子置于超低溫(-80 ℃)保存后，經透射電鏡觀察，發現精子頂體腫脹甚至脫落，細胞核與核膜分離，線粒體雙層膜被破壞，精子鞭毛呈不規則纏繞、斷裂甚至脫落[3]。而4℃海水中保存的精莢，其中的精子是否受冷休克影響而發生不可逆損傷，或海水滲透壓能否改變精子的活力等尚有待進一步探究。

本研究結果顯示，卵巢蛋白提取液可明顯促進精莢中精子釋放(9.5 h)，而副性腺蛋白液、精莢囊蛋白液、精巢蛋白液和纏卵腺蛋白液對精子釋放無顯著影響。持續觀察發現，與海水相比，精莢在副性腺蛋白液、精莢囊蛋白液、精巢蛋白液和纏卵腺蛋白液中保持完整形態的時間較短，這些蛋白液亦對精子釋放產生影響，但影響較弱。蛋白質是生命活動的主要承擔者，并參與能量供給。Cowey[10]研究發現不同質量和含量的蛋白質對虹鱒(Salmogairdneri)肝臟組織內某些酶的活力產生影響。由此推斷，本實驗中特定的組織蛋白液可能為金烏賊精莢中某些酶提供能量，促進了精子釋放，其中卵巢蛋白液的作用較為明顯。迄今，國內外學者針對精莢中精子釋放的影響因素開展了大量研究。曲迪[2]在對中華絨螯蟹的精莢破裂機制的研究中發現，精液、卵巢蛋白和納精囊蛋白均對精莢破裂無影響，而雄性副性腺蛋白在精莢破裂過程中發揮促進作用。Wang[11]通過硫酸銨沉淀、Sephacryl S-200凝膠層析柱和DEAE-Sephacel離子層析柱等實驗，從副性腺發育后期內容物蛋白中分離純化出一種約50 kDa的蛋白，這種蛋白可促進精莢破裂，并經過HPLC-ESI-MS/MS shotgun分析鑒定為組織蛋白酶A。顏躍弟[12]利用胰蛋白酶使日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)精莢破裂進而獲得存活率較高的游離精子。Takami[13]認為土鱉蟲(Carabusinsulicola)納精囊開口部位和輸卵管處的腺體或細胞可分泌某些蛋白酶使精莢破裂。還有學者認為，精莢在進入納精囊后，納精囊中的某些低分子量的化學物質可滲透進入精莢中，導致精莢破裂[14]。

本研究發現，金烏賊一個精莢中精子數量約為1.99×107個。在水溫30℃時，凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)精莢第一次再生后精子總數最高達1.49×107個[15]。只有處于激烈運動狀態時精子才能有效進入卵子，因此精子激烈運動時間是衡量精子活力的主要指標。金烏賊精子活力隨溫度的升高呈現先上升后降低的趨勢，精子活力最適溫度范圍為20.22～22.76℃，在21℃時精子活力最強，精子激烈運動時間和壽命分別為(116.67±6.67)和(206.67±6.67) min，這與膠州灣內金烏賊繁殖期海水溫度11～25 ℃相一致[5]。斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)精子的活力隨著溫度升高而逐步升高，當到達臨界溫度時又會下降，且精子活力的最適范圍為25～31 ℃[16]。長鰭籃子魚(Siganuscanaliculatus)和點籃子魚(Siganusguttatus)精子最適溫度范圍為20～25 ℃和25～30 ℃[17]。由此可見，魚類的適溫性不同，其精子活力的最高適溫范圍也隨之變化。暖溫性并具有精莢的金烏賊，其精子壽命和受精能力遠大于上述暖水性魚種，這也是對其特殊繁殖習性的一種適應。

某些體外受精的物種，其精子激烈運動時間和精子壽命較短，如斜帶石斑魚在29 ℃時精子活力達到最高，此時精子快速運動時間和精子壽命分別為27和37 min[16]，23.5 ℃時瓣結魚(Foliferbrevifilis)精子在0.45%～ 0.55%的NaCl溶液中劇烈運動時間和精子壽命最長，分別為33.5和172.5 s[18]，而一定劑量紫外線輻射下西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)精子壽命和激烈運動時間最高可達467和40 s[19]，遠低于金烏賊。有研究表明，海月水母(Aureliasp．)[20]和瑪麗魚(Poecilialatipinna)[21]等體內受精的物種，其精子壽命和激烈運動時間較長，水溫22 ℃時，海月水母精子快速運動時間和壽命分別為4 h 30 min和10 h。25 ℃時，瑪麗魚精子壽命長達3～5 h。21 ℃時金烏賊精子激烈運動時間和精子壽命較長，分別為(116.67±6.67)和(206.67±6.67) min，精子較長的激烈運動時間和壽命有助于體內受精，因此推測金烏賊的生殖方式應為體內受精，但粘附于口膜處的精莢，其精子釋放、入卵方式和精卵結合的場所等仍有待進一步探究。

4 結語

金烏賊卵巢蛋白提取液可明顯促進精莢中精子釋放，但具體是何種化學物質發揮作用仍需進一步探究。同時本研究明確了精子活力最高的適宜溫度為20.22～22.76 ℃。研究結果豐富了金烏賊繁殖生物學的內容，為有效開展頭足類人工繁育提供了科學依據。