梨黑斑病抗病相關基因PpEMS1的克隆與分析

段敏杰 伊洪偉 王進 武崢

（重慶市農業科學院，重慶 401329）

中國是梨原產國，也是世界第一產梨大國，梨產量占世界總產量的2/3，出口量約占世界總出口量的1/6，中國梨在世界梨產業發展中具有舉足輕重的作用［1］。重慶作為砂梨適宜種植區和長江流域砂梨主產區，2018年栽培面積維持在3.6×104hm2，總產量為47.3×105t。在實際生產栽培中，梨樹受到黑斑病、黑星病、輪紋病、炭疽病等多種真菌性病害的影響，梨樹病害已成為制約世界梨產業發展的主要因素［2］。其中，梨黑斑病是一種廣泛發生的世界性病害，尤其是在日本、韓國和中國南部砂梨產區發病嚴重［1］。梨黑斑病是由鏈格孢屬（Alternariasp.）真菌引起的一種病害［3］，主要侵染梨樹葉片、嫩枝和果實，造成早期落葉、果實畸形、龜裂，甚至落果，嚴重影響梨樹產量和梨果品質［4］。目前，防治黑斑病的方法主要是使用甲基托布津、多菌靈等化學藥劑，長期使用這些化學藥劑，不僅造成環境污染，同時也使部分菌株對化學藥劑敏感性降低，防治效果下降。而且，由于梨樹童期長，遺傳背景復雜，大部分品種自交不親和等特性，傳統的抗病育種成本高、效率低。通過分子生物學發掘梨抗病基因，利用分子抗病育種培育抗病良種可以縮短育種年限，提高育種效率，是解決梨黑斑病危害的有效途徑。

富亮氨酸重復序列受體樣蛋白激酶（The leucine-rich repeats receptor-like protein kinase，LRRRLK）是植物中已知的最大的一類跨膜類受體蛋白激酶［5］，它由胞外LRR結構域、單次跨膜域和胞內激酶結構域組成。1990年，Walker等［6］從玉米中首次發現LRR-RLK，之后越來越多的LRR-RLK被挖掘［7］。在擬南芥中，通過測序分析鑒定出至少223個LRR-RLKs［8］，其中超過30個通過遺傳和生化研究確定了其功能［9］。目前，已有研究表明，LRRRLKs的功能主要包括兩個方面：一是在植物的生長發育過程中發揮作用，如形態發生、器官形成和激素調節；二是參與植物生物和非生物脅迫應答反應［10］。Kim 等［11］和 Stahl等［12］研究發現，LRRRLKs中的BRI1、BAK1和CLV1在植物的生長和發育過程中發揮決定性的作用，而FLS2等其他LRRRLKs基因參與了植物自身防御反應［13］。

目前，已通過轉錄組測序獲得梨黑斑病抗病相關基因，但還需通過抗病基因精細定位與基因表達、功能驗證等方法相結合篩選梨黑斑病抗病關鍵基因。

本研究利用同源基因克隆方法獲得一個LRRLRK類抗病相關基因，利用生物信息學、Southern Blot、亞細胞定位等方法對該基因展開分析，同時，利用實時熒光定量PCR技術分析該基因在梨黑斑病誘導下的表達情況，為進一步研究其在梨抗病防御中的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

“黃花梨”（Pyrus pyrifolia）、“愛宕梨”（Pyrus pyrifolia）、“翠玉梨”（Pyrus pyrifolia）、“黃冠梨”（Pyrus pyrifolia×Pyrus bretschneideri） 均 來 自 重 慶市農業科學院果樹研究所梨資源圃。RNA提取試劑盒（Hipure Total RNA Mini Kit）、DNA提取試劑盒（HiPure SF Plant DNA Maxi Kit）、質粒提取試劑盒（HiPure Plasmid Micro Kit） 等 購 自 Magen（ 中國）。Southern blot試劑盒購自Roche（美國）。反轉錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit）、熒光染料（TB GreenTMPremix Ex TaqTM）等購自TaKaRa（中國）。PCR試劑、TGEM-T-easy、T4連接酶、大腸桿菌DH5α等購自TSINGKE（中國）。

梨黑斑病病原菌由重慶市農業科學院果樹研究所早熟梨課題組分離保存。

1.2 方法

1.2.1PpEMS1全長CDS的克隆 利用Hipure Total RNA Mini Kit（雙柱法）提取“黃冠梨”葉片總RNA，參照PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書反轉錄合成cDNA。根據白梨基因組數據庫，應用軟件primer5.0設計PpEMS1全長引物PpEMS1-f和PpEMS1-r，以黃冠cDNA為模板，進行PCR擴增，電泳產物回收后連接TGEM-T-easy載體，并通過熱激轉化法轉入大腸桿菌DH5α，涂布于LB/Amp固體培養基。挑取單菌落進行PCR驗證，并將陽性菌液送擎科生物技術有限公司進行測序。

1.2.2 生物信息學分析 利用vector軟件對測序結果進行分析，尋找最大開放閱讀框（Open reading frame，ORF）；利用SMART在線數據庫對蛋白結構域進行分析；利用ExPASY網站在線分析蛋白基本性質分子量、pI、氨基酸殘基組成、親疏水性等；在線（http：//wolfopsort.org/）預測亞細胞定位；在 線（http：//nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）預測核定位信號；利用ClustalX 2.0和MEGA 5.0構建PpEMS1與擬南芥部分已知功能LRR-RLKs家族基因的系統進化樹。

1.2.3PpEMS1的表達分析 采集黃花和愛宕嫩葉，以葉脈為中心，在葉背分別用無菌針頭創傷后接種梨黑斑病病原菌和無菌水，放置培養箱中。分別于1、2、3、4、5、6、7和8 d后提取葉片總RNA。

以RNA為反轉錄模板，參照PrimeScriptTMRT reagent Kit說明反轉錄合成cDNA。根據PpEMS1保守序列區設計熒光定量PCR引物E1-f和E1-r，以持家基因Actin為內參基因，應用life technologies公司生產的7500Fast熒光實時定量PCR儀（美國）進行熒光定量PCR分析（表1）。

PCR 反應體系（12 μL）為 6 μL TB Green Premix Ex Taq、1 μL cDNA、特異引物各 0.3 μL和ddH2O 4.4 μL。反應程序為 94℃ 3 min ；94℃ 30 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，40 個循環 ；72℃ 10 min。

表1 本研究所用引物序列

1.2.4 Southern Blot分析 采集“黃冠梨”、“黃花梨”、“愛宕梨”、“翠玉梨”嫩葉，利用HiPure SF Plant DNA Maxi Kit提取基因組DNA，并用BglⅡ和EcoR V完全酶切。根據PpEMS1保守序列區設計雜交探針，并與酶切產物在尼龍膜上雜交。探針標記、雜交及信號檢測等操作均按照雜交試劑盒（DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ，Roche）說明書進行。

1.2.5PpEMS1煙草瞬時表達分析 設計包含酶切位點KpnⅠ/BamHⅠ的引物，以測序正確質粒為模板擴增PpEMS1，并回收電泳產物。同時用KpnⅠ/BamHⅠ酶切電泳回收產物和pSAT6-mRFP-N1載體，酶切產物用T4連接酶進行連接，得到pSAT6-PpEMS1：mRFP-N1融合表達載體。進一步用KpnⅠ/XbaⅠ和KpnⅠ/SpeⅠ對中間載體Psat6-PpEMS1：mRFP-N1、Psat6-mGFP-N1和植物表達載體PLGN-35s-nos進行酶切，酶切產物經連接后得到表達載體PLGN-PpEMS1：mRFP-35s-nos和 PLGN-mGFP-35snos，轉入大腸桿菌DH5α，提取陽性克隆單菌落質粒酶切驗證后測序，測序結果正確的質粒轉化農桿菌。提取農桿菌陽性單菌落置于kan抗性的LB培養基，放于28℃搖床中震蕩培養24 h，轉速220 r/min。離心后重懸菌體，調節OD值至1。采用注射法進行本氏煙表皮轉化，24℃培養3 d后共聚焦顯微鏡觀察熒光信號。

2 結果

2.1 PpEMS1全長CDS克隆

根據PpEMS1的全長引物PpEMS1-f和PpEMS1-r，以“黃冠”cDNA為模板擴增獲得約3800 bp的基因片段（圖1），經測序分析，該基因全長3894 bp。

圖1 PpEMS1的CDS全長克隆

2.2 生物信息學分析

2.2.1 PpEMS1蛋白一級結構預測分析 ExPASY ProtParam tool在線預測分析表明，PpEMS1蛋白分子量為140.59 kD；理論等電點為5.42；該蛋白由20種氨基酸組成，其中Leu含量最多，Ser、Glu、Pro、Ala等含量較為豐富，Trp含量最少，堿性帶正電荷的氨基酸共128個，酸性帶負電荷的氨基酸共100個，整個蛋白為帶正電堿性蛋白；半衰期大于10 h；不穩定系數為32.95，屬穩定蛋白；平均親水性為0.041，屬親水性蛋白。

2.2.2 PpEMS1蛋白結構域分析 SMART在線數據庫分析顯示：PpEMS1蛋白激酶除具有引導信號肽SP外，還包括LRR-RLKs典型的亮氨酸重復結構域（Leucine-rich repeats，LRRs）、單跨膜結構域（Single transmembranous domain，STM）以及激酶活性結構域（Kinase domain，KD），其LRRs屬于胞外LRRs結構（圖2）。說明該蛋白激酶屬于LRR-RLK家族。

2.2.3 PpEMS1蛋白的亞細胞定位預測和NLS預測 Psort在線預測分析顯示該蛋白位于細胞質膜的得分最高；NLS預測顯示該蛋白激酶氨基酸序列1261-1294處為核定位序列。

2.2.4PpEMS1系統進化樹分析 通過查閱文獻和NCBI數據庫比對，獲得擬南芥（Arabidopsis thaliana）部分已知功能LRR-RLK相關基因，運用MEGA5.0軟件構建NJ系統進化樹（圖3），PpEMS1與擬南芥AtEMS1親緣關系最近，其次是AtBIR1。AtEMS1參與調控花藥體細胞及生殖細胞形態建成，AtBIR1參與調控植物抗性相關信號通路，與細胞防御反應相關。

圖2 PpEMS1蛋白保守結構域預測分析

圖3 PpEMS1系統進化樹分析

2.3 PpEMS1的表達分析

實時熒光定量PCR分析表明，“黃花梨”（較耐）和“愛宕梨”（易感）在接種梨黑斑病病原菌1、2、3、4、5、6、7和8 d后，“黃花梨”中，該基因的表達呈現先下降后逐漸升高，在6 d時達到最高點，之后逐漸降低；“愛宕梨”中，該基因的表達基本呈現先上升后下降的趨勢，在4 d的時候達到最高點。同時，4 d之前該基因的表達量在“愛宕梨”中均高于“黃花梨”，4 d后“黃花梨”中均高于“愛宕梨”（圖 4）。

圖4 “黃花梨”和“愛宕梨”接種梨黑斑病不同時期后PpEMS1的表達分析

2.4 PpEMS1的Southern Blot分析

對“黃冠梨”（HG）、“黃花梨”（HH）、“愛宕梨”（AD）、“翠玉梨”（CY）4個品種進行Southern Blot分析，結果（圖5）表明，在“黃冠梨”、“黃花梨”、“翠玉梨”中，該基因都以單拷貝形式存在，在“愛宕梨”中以多拷貝形式存在。

2.5 PpEMS1蛋白的亞細胞定位

構建基因與綠色熒光蛋白GFP的融合表達載體，經測序驗證，獲得正確融合表達載體。載體轉入農桿菌后通過注射法瞬時侵染本氏煙，注射后培養48 h，對本氏煙進行DAPI染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察葉片中基因的定位情況（圖6）。對照組中GFP蛋白在細胞膜和細胞核均存在，試驗組融合蛋白熒光信號在細胞膜和細胞核中均有表達。

圖5 PpEMS1的Southern Blot分析

圖6 PpEMS1蛋白激酶的亞細胞定位

3 討論

本研究從“黃冠梨”克隆獲得一個預測為富亮氨酸重復序列受體樣蛋白激酶EMS1的基因，暫命名為PpEMS1。Southern blot分析表明，在“黃花梨”、“翠玉梨”、“黃冠梨”中，該基因都以單拷貝形式存在，在“愛宕梨”中以多拷貝形式存在。實時熒光定量PCR分析表明，該基因受梨黑斑病誘導上調表達。該蛋白激酶具有一段NLS，亞細胞定位顯示融合蛋白在細胞質膜和細胞核均有表達，推測該蛋白激酶合成后可能分別在質膜和核膜發揮作用。

黑斑病病原菌可以在花期和果實生長發育時期通過各種途徑潛伏侵染，也可以通過氣孔和傷口侵染葉片，對果實和葉片造成傷害。當病原菌侵入健康的植物細胞和組織后，寄主植物細胞的正常生理功能遭到破壞，病原菌不僅奪取寄主植物的營養物質和水分，同時還給植物施加機械壓力并產生有害代謝產物，如酶、毒素等，使植株產生病癥。病原菌要侵入植物內，必須克服植物細胞壁的障礙，病原菌通過產生降解酶穿透細胞壁，破壞寄主細胞結構，有利于病原菌侵入。

已有多項研究表明，受體蛋白激酶參與植物的抗病防御過程。Song等［14］研究表明，水稻Xa21對水稻黃單胞菌具有抗病作用；在擬南芥中，FLS2與細菌鞭毛蛋白的感知有關［15］；富亮氨酸重復序列受體蛋白激酶BIR2是植物免疫系統中BAK1的負調控因子［16］；NIK1參與了植物抗病毒免疫反應過程［17］。

在擬南芥中，EMS1受體蛋白激酶被證實與小孢子細胞及絨氈層細胞分化有關，EMS1通過信號調節控制生殖細胞和周邊體細胞的命運［18］。在柑橘中，EMS受體蛋白激酶受柑橘潰瘍病誘導表達，推測該蛋白激酶可能參與植物的抗病防御過程［19］。目前只鑒定出少數LRR-RLKs類蛋白激酶的配體，TPD1是EMS1蛋白激酶的一種小富半胱氨酸蛋白配體［20］，可以與EMS1相互作用，誘導EMS1磷酸化，進而引起細胞內一些列生理生化反應［21］。研究表明，擬南芥β-碳酸酐酶（βCAs）是EMS1激酶的下游互作蛋白，其中βCA1和βCA4協同EPF2和CO2響應分泌蛋白共同調節氣孔的發育和運動［22-23］。在植物木質部纖維中，富亮氨酸重復序列受體樣蛋白激酶PXC1參與了植物細胞壁的形成［24］，EMS1與細胞分化相關，它是否也參與到植物次生細胞壁的形成，并在病原菌侵染細胞壁時發揮作用，有待進一步研究。

4 結論

從“黃冠梨”中克隆獲得一個LRR-RLK家族基因PpEMS1，它以不同拷貝數存在于不同梨基因組中，其蛋白作為跨膜蛋白，主要在細胞膜發揮作用，可能參與了梨黑斑病抗病防御過程。