岷縣黑裘皮羊微衛星多態性及與生產性狀的關聯分析

張瑞 郎俠 吳建平，3 王彩蓮 梁婷玉，3

（1. 甘肅省農業科學院 畜草與綠色農業研究所，蘭州 730030；2. 甘肅省牛羊種質與秸稈飼料化重點實驗室，蘭州 730030；3. 西北師范大學新農村發展研究院，蘭州 730070；4. 甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 730070）

岷縣黑裘皮羊是甘肅省地方裘皮用綿羊品種，以生產黑色二毛裘皮著稱，其主產區位于甘肅洮河和岷江上游的17個鄉鎮，境內植被覆蓋率高，可食性牧草資源豐富。因此，岷縣黑裘皮羊是在當地獨特的生態環境條件下結合長期的人工選擇培育而成的［1］。近年來，岷縣黑裘皮羊受產業結構調整、禁牧措施實施、雜交育種等因素的影響，分布范圍大幅壓縮，存欄量不斷減少，由上世紀80年代的10萬余只銳減到3000余只［2］，是國家采用搶救性措施保存下來的品種，2006年被列入《國家級畜禽遺傳資源保護名錄》；2016年被再次列入《全國畜禽遺傳資源保護和利用“十三五”規劃》瀕危品種。

畜禽遺傳資源不僅是現代農業創新的物質基礎，而且是維持生物多樣性，國家生態安全和農業安全的重要戰略物質，因此，保護和利用好畜禽遺傳資源意義重大。而微衛星標記是分布于真核生物基因組中、由1-6個核苷酸串聯重復組成的具有共顯性、數量多、易檢測、多態性豐富等特點的分子標記技術，被認為是理想的可用于評估家畜遺傳多樣性的方法［3］。王斌等［4］通過計算秦巴山區黃牛群體的遺傳信息、遺傳距離及聚類分析，為研究該品種的遺傳適應特點，預測雜交優勢，制定育種戰略等提供了科學依據；Suh等［5］選取30個位點分析了韓國4個本地牛與荷斯坦和夏洛來牛的系統發生關系、遺傳距離及遺傳多樣性，驗證了當地牛遺傳資源的獨特性。Tefiel等［6］、Kumar等［7］、王可等［8］和邱小宇等［9］對阿爾及利亞、印度山羊品種、濟寧青山羊等地方綿羊品種的遺傳多樣性做了分析，確定了可用于遺傳標記的位點，豐富了地方綿羊品種的遺傳資源。Fang等［10］和趙思思等［11］分別對中國香豬和河北黑豬品種進行微衛星分析，為該地區豬種質資源的合理保護和品種選育提供了依據。黃勛和等［12］、李紅偉等［13］對我國的烏骨雞和惠陽胡須雞進行了評價，對該品種的選育潛力進行了評價。此外，還有研究表明微衛星DNA可作為畜禽育種改良的分子標記。王斌等［14-15］利用12對微衛星引物對西鎮牛和宣漢牛生長發育性狀進行關聯分析，結果發現12個位點各基因型與西鎮牛生長發育性狀具有關聯性，而11個位點與宣漢牛生長發育性狀具有關聯性。決肯·阿尼瓦什等［16］、任坤剛等［17］和梁慶玲等［18］用不同微衛星位點對巴什拜羊、薩福克羊和無角陶賽特羊生長性狀進行關聯性分析，找到了與各性狀相關聯的位點，為該性狀的改良提供了理論依據。目前，關于岷縣黑裘皮羊微衛星遺傳多樣性與生產性狀間關聯效應的研究鮮有報道，因此本研究從種質資源保護和性狀改良角度出發，分析了10個微衛星位點在岷縣黑裘皮羊群體中的遺傳多樣性，并對所選微衛星位點各基因型與體重、體高、體長、胸寬、胸深和胸圍的關聯性進行分析，以期為該品種的保護和生產性狀改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 根據數量遺傳學的抽樣方法，在岷縣黑裘皮羊中心產區，采用典型群隨機抽樣法，選擇12、24和36月齡各48只，共144只外貌特征明顯、體況相近的岷縣黑裘皮羊，靜脈采血10 mL，裝入有EDTA抗凝劑的真空采血管中，記錄血樣編號，24 h內帶回實驗室，-20℃保存，用于后續試驗。并測定其體重、體高、體長、胸寬、胸深和胸圍指標。

1.1.2 設備與儀器 KOD-201B-KOD-Plus購于東洋紡（上海）生物技術有限公司；DSMO-100-Liz 500購于克勞寧（北京）生物科技有限公司；蛋白酶K、瓊脂糖、Loading Buffer、DL 2000 Marker均購于天根生化科技（北京）有限公司。

DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；DL9700 TOUCH型PCR儀（北京東林昌盛生物科技有限公司）；5424R冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；3730型基因測序儀（美國ABI公司）；JY04S-3C型凝膠成像分析儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；DY-Ⅲ型高壓電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 微衛星DNA多樣性檢測

1.2.1.1 微衛星位點的選擇 根據聯合國糧農組織（FAO）（http：//www.fao.org）的推薦，選擇10對可用于評價綿羊生產性狀的微衛星位點，分別進行5 '端FAM（藍色）、HEX（綠色）、ROX（紅色）、TAMRA（橙色）熒光修飾，引物由武漢金開瑞生物有限公司合成，引物信息見表1。

表110對微衛星引物信息

1.2.1.2 基因組DNA的提取 基因組DNA的提取參照《分子克隆實驗指南》（第三版），采用常規酚、氯仿抽提法提取。并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果，將符合試驗要求的DNA于-80℃保存備用。

1.2.1.3 PCR反應體系 PCR反應總體系為25 μL：10×KOD Buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNTPs 2 μL，25 mmol/L MgSO40.5 μL，10 μmol/L Forward 1 μL，10 μmol/L Reverse 1 μL，Template DNA 1 μL，KOD-Plus 1 U，補水至 25 μL。

PCR 擴增程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，65℃-55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，10 個循環后，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環后，68℃修復延伸7 min，于4℃保存。

1.2.1.4 毛細管電泳檢測PCR 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，利用ABI-3730基因測序儀進行毛細管電泳，并對電泳結果采用Gene Marker進行標準化分析。

1.2.2 數據處理 根據毛細管電泳結果，將各個位點的等位基因按照片段大小由小到大依次編號為A-O；利用Popgene32軟件計算等位基因頻率（Alleles frequency）、等位基因數（Numbers of alleles，Na）、有效等位基因數（Effective numbers of alleles，Ne）、期望雜合度（Expected heterozygosity，He）、觀測雜合度（Observed heterozygosity，Ho）等；PIC軟件計算多態信息含量（Polymorphism information content，PIC）。

采用Microsoft Excel 2016對試驗數據進行整理后，選擇基因型樣本數≥4的個體，利用SPSS 21.0一般線性模型（GLM）程序，采用最小二乘方差分析微衛星位點的基因型對生產性狀影響的效應，一般線性模型為：

其中：Yij為個體表型值，μ為群體性狀均值，ai為個體基因型效應，bj為個體月齡效應，eijk為隨機殘差效應。若位點與性狀顯著關聯時，運用LSD進行多重比較，若同一位點只有2種基因型，采用獨立性t檢驗分析。P＞0.05表示無顯著差異，P＜0.05表示差異顯著，結果用“均值±標準誤”表示。

2 結果

2.1 DNA提取及電泳檢測

提取的樣品DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，所有DNA條帶清晰均勻，亮度較大；PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖電泳檢測后，無明顯雜帶，無引物二聚體產生，可用于后續試驗；利用基因測序儀對每個位點等位基因進行分型，結果顯示所有電泳圖峰型較完整。圖1所示為3號個體在位點MCM140上177/181 bp基因型，圖2為2號個體在位點OarJMP29上136/136 bp基因型。

2.2 岷縣黑裘皮羊微衛星遺傳多樣性分析

岷縣黑裘皮羊10對微衛星引物的遺傳多樣性信息見表2。所有位點等位基因數范圍為9-15，群體平均等位基因數為11.2個；有效等位基因數范圍為2.9313-8.2433，群體平均有效等位基因數為4.4508；觀測雜合度范圍為0.2500-0.7143，群體平均觀測雜合度為0.5218；期望雜合度范圍為0.6658-0.8879，群體平均期望雜合度為0.7657；多態信息含量范圍為0.6156-0.8673，群體平均多態信息含量為0.7289。說明岷縣黑裘皮羊具有豐富的遺傳多樣性。

圖13號個體在位點MCM140的檢測結果

圖22號個體在位點OarJMP29的檢測結果

2.3 岷縣黑裘皮羊微衛星位點與生產性狀的關聯分析

由表3可知，位點OarHH47各基因型在12和24月齡岷縣黑裘皮羊生產性狀間差異無顯著性（P＞0.05）。36月齡時，GG型個體體重顯著高于DD和DI型（P＜0.05）；DD型個體體高顯著低于其它個體（P＜0.05）。

由表4可知，24月齡岷縣黑裘皮羊生產性狀在位點OarVH72各基因型間差異無顯著性（P＞0.05）。12月齡時，CC型個體體高顯著高于CI型（P＜0.05）。36月齡時，BI型個體體重和胸寬均顯著高于CC、CI和 FI型個體（P＜0.05）。

由表5可知，12和24月齡岷縣黑裘皮羊生產性狀在位點OarCB226各基因型間差異無顯著性（P＞0.05）。36月齡時，AA和AJ型個體體重顯著高于BB型（P＜0.05）；AJ型個體胸寬顯著高于BB和AA型（P＜0.05），AB型與AJ和BB型間差異無顯著性（P＞0.05）；AJ型個體胸深顯著高于AA和BB型（P＜0.05）。

表210個微衛星位點多態信息

表3 位點OarHH47不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產性狀的差異

表4 位點OarVH72不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產性狀的差異

表5 位點OarCB226不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產性狀的差異

由表6可知，24和36月齡岷縣黑裘皮羊生產性狀在位點ILSTS28各基因型間差異無顯著性（P＞0.05）。12月齡時，CI型個體體高顯著高于AD、II和JJ型，且顯著高于DJ型（P＜0.05）；胸寬性狀上，CI型個體數值最大，且顯著大于DJ、II和JJ（P＜0.05），與AD型間無顯著差異性，同時，II型與DJ和JJ型間差異也無顯著性（P＞0.05）。

表6 位點ILSTS28不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產性狀的差異

由表7可知，12月齡岷縣黑裘皮羊生產性狀在位點MCM140各基因型間差異無顯著性（P＞0.05）。24月齡時，EH型個體體高顯著低于EE、EG型（P＜0.05），與FF和GG型間無顯著差異（P＞0.05）；胸圍性狀上，GG型個體顯著高于EG（P＜0.05），與EE、EH和FF型間無顯著差異（P＞0.05）。36月齡時，GG型個體體高顯著低于AF和FF型，與EG型間無顯著差異（P＞0.05）；GG型個體胸圍顯著低于AF、EG和FF型（P＜0.05），AF、EG和FF型間無顯著差異（P＞0.05）。

表7 微衛星位點MCM140不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產性狀的差異

位點OarFCB193各基因型與岷縣黑裘皮羊生產性狀的關聯分析結果見表8。12月齡時，CC型個體體長和胸圍均顯著高于FF型個體（P＜0.05），與CF型無顯著差異（P＞0.05）。24月齡時，CF型個體體重和胸圍顯著高于FF型（P＜0.05）；體高顯著高于FF和FI型（P＜0.05）。36月齡時，FF型個體體重顯著高于FH型（P＜0.05）；體高、胸寬和胸圍性狀上，FF和FH型個體顯著高于CF型（P＜0.05）。

表8 位點OarFCB193不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產性狀的差異

位點OarFCB304各基因型與岷縣黑裘皮羊生產性狀的關聯分析結果見表9。12月齡時，FM型個體體重顯著低于EE和FF型（P＜0.05）；EE型個體胸深顯著高于FF和FM型（P＜0.05）。24月齡時，FF型個體胸深顯著高于EE型（P＜0.05），與CC型無顯著差異（P＞0.05）。36月齡時，EE型個體體長顯著高于CC和FF型，胸寬顯著低于CC和FF型（P＜0.05）。

表9 位點OarFCB304不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產性狀的差異

位點OarJMP29各基因型與岷縣黑裘皮羊生產性狀的關聯分析結果見表10。12月齡時，EE型個體在體高和胸深性狀上顯著高于AG型（P＜0.05）。24月齡時，EE型個體體重和胸圍均顯著高于FF型（P＜0.05）。36月齡時，EE型個體體重顯著低于GI型，胸圍顯著高于GI型（P＜0.05）。

表10 位點OarJMP29不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產性狀的差異

由表11可知，36月齡岷縣黑裘皮羊生產性狀在位點MAF70各基因型間差異無顯著性（P＞0.05）。12月齡時，在體重、體高、體長和胸圍性狀上，FJ型個體顯著高于DI型（P＜0.05）。24月齡時，DK型個體體高顯著高于DD型（P＜0.05）。

表11 位點MAF70不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產性狀的差異

由表12可知，36月齡岷縣黑裘皮羊生產性狀在位點MAF209各基因型間無顯著差異（P＞0.05）。12月齡時，CC型個體胸深顯著高于DD和DF型（P＜0.05）。24月齡時，體重性狀上，DG和DI型個體數值最大，且顯著大于AA、CC和DD型（P＜0.05），DD與AA和CC型間無顯著差異（P＞0.05）；體長性狀上，DG型個體顯著高于其它各型（P＜0.05）；胸圍性狀上，DD、DG和DI型個體顯著高于AA、CC和 DF 型（P＜0.05）。

表12 位點MAF209不同基因型間岷縣黑裘皮羊生產性狀的差異

3 討論

3.1 岷縣黑裘皮羊微衛星遺傳多樣性

分析群體遺傳多樣性時，一方面要求所選的樣本量能夠反應整個群體，另一方面，選擇合理的微衛星位點和數目對研究群體平均基因多樣性至關重要。有研究表明［19-20］，當樣本量在25-50時，樣本量與期望雜合度無相關性，與等位基因數呈正相關。本試驗研究的樣本量是144，符合樣本量要求，可以反映整個群體的遺傳多樣性。其次，根據FAO的建議，所選位點應至少有4個及以上的等位基因，一般選擇5-19個為宜，且所選位點要盡可能的均勻分布于不同染色體上。試驗中所選的10個微衛星標記，分布于不同染色體，等位基因數在9-15之間，能夠提供足夠多的遺傳信息，對岷縣黑裘皮羊遺傳多樣性的研究可以提供可靠依據。

微衛星遺傳多樣性不僅可以反映群體的遺傳變異歷史，而且可以為后期的保種選育提供可靠信息。有效等位基因數值與等位基因數絕對值的接近程度可以反映等位基因在群體中是否分布均勻，所選的10個微衛星位點中，有效等位基因數和等位基因數值均相差較大，表明等位基因在該群體中分布不均勻。雜合度是度量群體遺傳變異最合適的參數之一，平均雜合度的高低可以反映群體的遺傳一致性程度，平均雜合度越高，遺傳變異越大。因觀測雜合度受樣本量影響較大，期望雜合度常被用來衡量群體的遺傳多樣性大小，兩者的接近程度反映人工和自然選擇對群體影響的大小。所選10個標記中，OarCB226位點觀測雜合度和期望雜合度接近程度最高，說明該位點是岷縣黑裘皮羊最原始的等位基因，其它9個位點可能受到了人工和自然的高強度選擇，遺傳變異程度較高。多態信息含量（PIC）是衡量DNA片段多態性的指標，Purvis認為PIC大于0.7為最好的遺傳標記［21］。所選10個位點中，7個位點PIC大于0.7，表明所選位點遺傳變異程度較高，可用于評價該群體的遺傳多樣性。

3.2 岷縣黑裘皮羊微衛星位點與生產性狀關聯性

生產性狀一般認為是由微效多基因控制的數量性狀，由于某些基因效應微小，很難根據表型值將其區分開來，但隨著分子標記技術的發展，可以利用DNA標記分析染色體片段或基因座的遺傳規律來研究基因的效應［22］。關聯分析是利用基因間的連鎖不平衡，對表型值和基因間的相關性進行分析，從而鑒定與表型變異相關的基因位點［23］，在實際應用中，根據王斌等［15］的研究結果，一般選擇個體數≥4的基因型進行關聯分析。所選10個位點均與生產性狀表現出不同程度的關聯性，且出現了幾個位點與同一性狀相關或一個位點與多個性狀表型值相關的現象。王玉琴等［24］對太行黑山羊進行微衛星位點研究時發現，位點MAF70的155/155 bp基因型與體重、165/192 bp與體高呈正相關，劉德穩等［25］對魯山牛腿山羊微衛星多樣性與體尺性狀的相關性研究發現，MAF70位點159 bp和180 bp對體重具有正效應，等位基因144 bp和159 bp對體高、胸深和胸圍具有負效應。本研究中，MAF70位點各基因型對36月齡岷縣黑裘皮體尺性狀無顯著影響，但含有等位基因F（140 bp）和J（150 bp）的基因型與12月齡岷縣黑裘皮羊體高、體重、體長和胸圍呈顯著正相關；含等位基因K（154 bp）的基因型的24月齡岷縣黑裘皮羊體高顯著高于其它各型。

此外，本試驗也發現了其它與岷縣黑裘皮羊生產性狀具有關聯性的位點。其中，12月齡時，與體重相關的位點有2個：OarFCB304、MAF70；與體高相關的位點有4個：OarVH72、ILSTS28、OarJMP29、MAF70；與體長相關的位點有2個：OarFCB193、MAF70；與胸寬相關的位點有1個：ILSTS28；與胸深相關的位點有3個：OarFCB304、OarJMP29、MAF209；與胸圍相關的位點有2個：OarFCB193、MAF70。24月齡時，與體重相關的位點 有 3個：OarFCB193、OarJMP29、MAF209；與體高相關的位點有3個：MCM140、OarFCB193、MAF70；與體長相關的位點有1個：MAF209；與胸寬相關的位點有0個；與胸深相關的位點有1個：OarFCB304；與胸圍相關的位點有4個：MCM140、OarFCB193、OarJMP29、MAF209。36月 齡 時， 與體重相關的位點有5個：OarHH47、OarVH72、OarCB226、OarFCB193、OarJMP29；與體高相關的位點有3個：OarHH47、MCM140、OarFCB193；與體長相關的位點有1個：OarFCB304；與胸寬相關的位點有4個：OarVH72、OarCB226、OarFCB193、OarFCB304；與胸深相關的位點有1個：OarCB226；與胸圍相關的位點有3個：MCM140、OarFCB193、OarJMP29。

4 結論

本研究所選10個微衛星位點在該岷縣黑裘皮羊群體中均具有豐富的遺傳多樣性，且與12、24和36月齡的體重、體高、體長、胸寬、胸深和胸圍具有不同程度的關聯性。研究結果從分子水平上為岷縣黑裘皮羊的保種、早期選育和高效育種提供了理論依據。