偽狂犬病毒的gE蛋白胞外區真核表達以及單克隆抗體制備

郎巧利 吳夢 黃楠 何琦琳 葛良鵬 楊希

（重慶市畜牧科學院生物工程研究所，重慶 402460）

偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是的一種由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染引起的，能引發多種動物奇癢、發熱、腦脊髓炎的急性傳染病，又稱Aujeszky病。其主要感染豬，仔豬感染后表現為嚴重的中樞神經癥狀，引發急性死亡，死亡率可達100%。成年豬感染后可長期潛伏帶毒，引發種豬不育、妊娠母豬繁殖障礙等癥狀，給我國養豬業造成了極大的經濟損失［1-2］。

PRV是豬皰疹病毒I型病毒，屬于皰疹病毒科和α-皰疹病毒亞科，是雙鏈線狀DNA病毒。其中，gE是PRV重要的毒力基因，全長1.7 kb，位于病毒基因組US區，編碼的蛋白屬于I型跨膜糖蛋白［3］，在介導細胞之間病毒的擴散、細胞的感染融合、病毒粒子的釋放以及病毒侵襲神經系統等方面均起著重要作用［4-5］。近年來，PRV已在很多國家養豬業中得到凈化，中國也頒布了相關的凈化計劃。gEELISA診斷技術和gE基因缺失疫苗作為目前偽狂犬病防控的主要手段，是偽狂犬病能否凈化的關鍵［6］。

目前國內外報道中［7-14］，PRV gE蛋白的表達方式主要有原核表達、昆蟲細胞表達和酵母細胞表達3種。然而，原核表達系統的缺點是包涵體蛋白不易純化、蛋白修飾不完整、表達的蛋白生物活性低。昆蟲細胞表達系統的缺點是效率比較低，載體構建時間長，桿狀病毒表達系統所能表達的外源蛋白基本為非分泌蛋白，不能表達帶有完整N聯聚糖的真核糖蛋白。而酵母表達系統存在克隆基因的表達量低，發酵時間長，不正確的蛋白糖基化及抗細胞分裂，培養上清多糖濃度高不利于純化等缺點。與上述3種表達系統相比，哺乳動物細胞表達系統雖然成本偏高，但表達的蛋白基本是可溶性蛋白，便于純化和產業化，且其翻譯后再加工修飾產生的外源蛋白質，就活性而言，遠勝于原核、昆蟲細胞及酵母細胞表達系統，最接近于天然蛋白質。

為了表達PRV gE蛋白，本研究設計了2種重組表達方式［gE-6×His和 gE-mouse Fc（gE-mFc）］，將其在哺乳動物細胞表達系統HEK293F細胞中進行瞬時表達，比較其表達情況，以期獲得表達量高純度好的分泌性gE蛋白。用PRV滅活全病毒免疫小鼠，利用獲得的gE蛋白通過間接ELISA篩選和IFA鑒定出9株穩定性和特異性好的分泌陽性雜交瘤細胞株，以期為PRV診斷試劑的開發奠定良好的物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、病毒、細胞及實驗動物 pcDNA3.4載體購自invitrogen；pcDNA3.4-mFc2載體由重慶市畜牧科學院生物工程所保存；偽狂犬病全病毒株和gE缺失株由成都安迪斯生物技術有限責任公司贈予；SP2/0細胞和PK-15細胞均保存于重慶市畜牧科學院生物工程所；HEK293F瞬時表達系統試劑盒購自北京諾進生物技術有限公司；6-8周齡Balb/C小鼠購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.1.2 主要試劑 質粒提取試劑盒購自全式金公司；胰蛋白胨（Tryptone）和酵母提取物（Yeast extract）購自 OXOID；感受態細胞DH5α、TaqDNA聚合酶、DNA限制性內切酶均購自TaKaRa公司；DNA Marker購自廣州東盛生物科技有限公司；Ni-NTA純化柱和Protein G純化柱均購自GE公司；陰離子純化柱購自博格隆（上海）生物技術有限公司；蛋白濃縮管購自eppendorf公司；弗氏佐劑購自sigma公司；ClonaCellTM-HY培養基D購自STEMCELL公司；1640培養基購自Hyclone公司；HT培養基購自Gibco公司；電融合液購自BTX公司；鼠抗his單克隆抗體購自santa cruz公司；抗鼠IgG（H+L）的熒光二抗購自invitrogen；羊抗鼠IgG-Fab HRP抗體購自sigma公司；FITC標記的羊抗鼠IgG抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 gE-6×His重組蛋白真核表達載體的構建 根據NCBI發 表 的PRV gE基 因 序 列（GenBank：KX266909.1），對gE蛋白信號肽在http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/網址在線預測，對gE蛋白跨膜區在http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/網址在線預測。找出gE蛋白信號肽、胞外區序列并在N端加上Kozak sequence和HindIII酶切位點，C端加上His標簽和EcoRI酶切位點進行合成，構建入pcDNA3.4真核表達載體中。質粒測序正確后，命名為 pcDNA3.4-gE-6×His。

1.2.2 gE-mFc重組蛋白真核表達載體的構建 從pcDNA3.4-gE-6×His載體中擴增目的片段，并在兩端加入HindIII和EcoRI酶切位點，（擴增上游引物：5'-aagcttGCCACCATGCG-3'；擴增下游引物：5'-TGAAGTAATAAGaattc-3'）將目的片段構建入實驗室已有的含小鼠IgG2-Fc基因片段（705 bp）的pCDNA3.4-mFc真核表達載體中。質粒測序正確后，命名為pCDNA3.4-gE-mFc。

1.2.3 重組gE蛋白的表達、純化和鑒定 將已鑒定的重組質粒轉化入大腸桿菌感受態細胞DH5α中，挑取單個菌落接種于LB培養基中，37℃，200r/min搖床培養過夜，收取菌液進行質粒無內毒素提取，將大提的質粒用0.45 μm濾膜過濾后備用。準備HEK293F細胞，轉染前一天，取對數生長期的HEK293F細胞按0.8×106cells/mL密度進行傳代至200 mL培養基中。轉染時，準備2個無菌EP管各加入2 mL HEK293F基礎培養基，分別加入200 μg質粒DNA和600 μL 轉染試劑，混勻室溫孵育5 min。將轉染試劑稀釋液快速加入DNA稀釋液中，室溫孵育15-20 min。將 DNA 與轉染試劑混合液快速加入細胞懸液，分別在轉染 48 h、96 h、144 h 后加入HEK293F補料培養基10 mL，待細胞活率降至60%左右時，離心收取細胞上清液，進行Western blot鑒定其表達情況。表達的gE-6×His蛋白用Ni-NTA柱和陰離子交換柱純化，gE-mFc蛋白用Protien G柱純化，并進行SDS-PAGE鑒定純化情況。

1.2.4 小鼠免疫 將PRV全病毒用5×PEG8000-NaCl進行純化濃縮，并溶于PBS中，用Nanodrop2000微量紫外分光光度計測得病毒濃度。向病毒溶液中加入0.1%-0.2%的甲醛37℃滅活過夜，取終濃度為2 mg/mL的滅活PRV全病毒，以1∶1（V/V）加入弗氏佐劑，接種6-8周齡Balb/C小鼠，每間隔2周免疫一次。首次免疫，加弗氏完全佐劑，皮下多點注射，200 μL/只；再次免疫，加弗氏不完全佐劑，腹腔注射，200 μL/只。三免一周后采微量尾血包被PRV滅活全病毒進行ELISA測定，抗體效價達到1∶10000以上的小鼠，雜交瘤融合前3 d，取200 μg抗原不加佐劑進行加強免疫。

1.2.5 單克隆抗體的制備 取SP2/0細胞與免疫小鼠脾細胞按1∶5混合，加入電融合液進行電融合，融合后細胞用ClonaCellTM-HY半固體培養基D培養，10-14 d后挑取單克隆至HT培養基中，培養2-3 d后觀察培養基顏色變黃以后，取細胞上清，以gE-mFc表達蛋白為檢測抗原包被ELISA板，以羊抗鼠IgG-Fab HRP抗體為二抗進行間接ELISA，篩選陽性細胞克隆株。將陽性克隆全部凍存，并進行有限稀釋，用間接ELISA檢測，直至單克隆全陽性為止，擴大培養高陽性的單克隆，凍存備用。

1.2.6 間接免疫熒光試驗（IFA）鑒定單克隆抗體 將PK-15細胞傳代至24孔板中，待細胞長成單層后，分別接種PRV全病毒株和PRV gE缺失株，同時設正常細胞對照。24 h后待細胞出現輕微病變，用-20℃預冷的甲醇室溫固定10 min，PBS洗3遍，5%BSA 37℃封閉1 h，加入待檢的雜交瘤培養上清，4℃孵育過夜。PBS洗3遍，避光加入1∶1000稀釋的FITC標記的羊抗鼠IgG，37℃避光孵育1 h，PBS洗3遍，在熒光顯微鏡下觀察熒光。

2 結果

2.1 gE蛋白序列生物信息學分析

通過 http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/網站對gE蛋白跨膜區預測，可知gE蛋白1-430位氨基酸位于細胞膜外（胞外區）、431-453位氨基酸位于跨膜區、454-578位氨基酸位于胞質內（胞內區），其中胞外區的1-430位氨基酸是gE蛋白的主要抗原區域，結果如圖1。通過http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP網站對gE蛋白信號肽預測，可知1-20位氨基酸是gE蛋白的信號肽，結果如圖2。因此，本研究擬表達gE蛋白胞外區的1-430位氨基酸。 通 過 https：//www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GLYCOSITE/glycosite.html網站預測gE蛋白胞外區N-糖基化位點，發現其共有5個潛在的N-糖基化位點，結果如圖3。通過http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/網站預測gE蛋白胞外區O-糖基化位點，發現其分別第25、27、30、31、36、40、42、305、393、410、411、425位氨基酸共有12個潛在的O-糖基化位點。

2.2 表達載體的鑒定

如圖4所示，用HindIII和EcoRI對測序正確的pcDNA3.4-gE-6×His質粒進行酶切鑒定，結果得到大小與預期的1335 bp和5987 bp一致的兩條帶。如圖5所示，用HindIII和PvuI對測序正確的pcDNA3.4-gE-mFc質粒進行酶切鑒定，得到大小與預期的1480 bp和6529 bp一致的兩條帶。

圖1 gE蛋白跨膜區預測結果

圖2 gE蛋白信號肽預測結果

圖3 gE蛋白胞外區N-糖基化位點預測結果

圖4 pcDNA3.4-gE-6×His質粒酶切鑒定

圖5 pcDNA3.4-gE-mFc質粒酶切鑒定

2.3 gE-6×His蛋白表達、純化和鑒定

取pcDNA3.4-gE-6×His轉染的HEK293F細胞上清，用濃縮管濃縮10倍，將原液和濃縮液以30 μL體積上樣SDS-PAGE 電泳并電轉移至PVDF膜，用5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗滌后，用1∶1000稀釋的鼠抗His單克隆抗體，4℃孵育過夜，再用1∶10000稀 釋 Alexa FluorTM680 donkey anti-mouse IgG（H+L）室溫孵育1 h后顯色，結果如圖6。由結果可知，與原液比較，濃縮后樣品能夠在100 kD和70 kD成功檢測到目的蛋白。說明gE-6×His蛋白成功表達，但表達量很低，表達的目的蛋白分子量和預期的（45 kD）比較偏大，可能是糖基化修飾所致。

將轉染pcDNA3.4-gE-6×His質粒的細胞上清先后用Ni-NTA柱和陰離子交換柱進行純化，純化后的蛋白進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色，結果如圖7，發現gE-6×His蛋白進行2次純化后，其純度仍然不高，且蛋白穩定性太差，蛋白在濃縮和純化的過程出現沉淀和降解，分析可能是蛋白的結構不夠穩定，聚集性太強。

圖6 gE-6×His蛋白表達Westernblot鑒定圖

2.4 gE-mFc蛋白表達、純化和鑒定

為解決gE-6×His蛋白遇到的表達量低，蛋白穩定性太差，且不能純化到純度較高的蛋白的問題。本研究重新設計了pcDNA3.4-gE-mFc質粒，表達得到gE-mFc蛋白。取pcDNA3.4-gE-mFc轉染的HEK293F細胞上清，以30 μL體積上樣SDS-PAGE電泳并電轉移至PVDF膜，用5% 脫脂奶粉室溫封閉 1 h，洗滌后，用1∶10000稀釋Alexa FluorTM680 donkey anti-mouse IgG（H+L）室溫孵育1 h后顯色，結果如圖8。由結果可知，樣品能夠在100 kD到190 kD之間成功檢測到目的蛋白。說明gE-mFc蛋白成功表達，且表達量較gE-6×His有明顯提高，但由于糖基化修飾，表達的目的蛋白分子量較預期（70 kD）偏大。

圖7 gE-6×His蛋白純化SDS-PAGE電泳圖

圖8 gE-mFc蛋白表達Westernblot鑒定圖

將轉染pcDNA3.4-gE-mFc質粒的細胞上清用Protein G柱進行純化，純化后的蛋白進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色，結果如圖9，發現gE-mFc蛋白進行純化后，其純度較gE-6×His蛋白有明顯提高，且蛋白穩定性好，不會出現蛋白沉淀和降解的情況。

2.5 雜交瘤細胞株的獲得

為了快速獲得gE單克隆抗體，本研究選擇在蛋白表達初期利用PRV滅活全病毒免疫小鼠，細胞融合后，再利用表達的gE-mFc蛋白進行篩選。經細胞融合和ELISA 初步篩選，得到20株陽性克隆，又進行2次單克隆，直至所有克隆孔的陽性反應率達100%，最后獲得9株穩定分泌的能和gE-mFc表達蛋白發生陽性反應的細胞株（圖10）。

圖9 gE-mFc蛋白純化SDS-PAGE電泳圖

圖10 ELISA篩選特異性gE-mFc單克隆抗體

2.6 IFA鑒定gE單克隆抗體特異性

IFA檢測gE單克隆抗體與PRV全病毒株和PRV gE缺失株特異性結合反應。結果顯示（圖11），9株gE單克隆抗體4A、2E、4C、8E、8E-10F、8F、6C、10F和8D均能與PRV全病毒株反應，而不能與PRV gE缺失株以及對照的PK-15細胞反應，證明9株單克隆抗體能特異性結合PRV的gE蛋白。

圖11 IFA鑒定gE蛋白單克隆抗體特異性

3 討論

PRV gE蛋白由胞外區、跨膜區和胞質區構成，研究已發現了6個抗原表位，其中5個抗原位于N端52-238位氨基酸［15］。由于gE蛋白是一種非必需的囊膜糖蛋白，PRV缺失gE基因后不會影響其復制和免疫原性，但毒力卻大大減弱，目前gE基因缺失疫苗廣泛使用于全國各大豬場，gE蛋白成為了區分PRV疫苗株和野毒株的重要標志性蛋白。因此，可溶性gE蛋白和gE特異性單克隆抗體在PRV的防治和凈化過程中起著重要的作用。

本研究通過生物信息學的手段預測了gE蛋白的信號肽、胞外區、跨膜區和糖基化位點。根據在線程序signalP4.1預測其信號肽位于1-20位氨基酸。根據TMHMM2.0預測其21-430位氨基酸位于細胞膜外（胞外區）、431-453位氨基酸位于跨膜區、454-578位氨基酸位于胞質內（胞內區）。

根據預測結果，本研究構建了真核表達載體pcDNA3.4-gE-6×His和pcDNA3.4-gE-mFc兩種表達載體，將gE胞外區域（21-430 aa）分別與6×His和mFc融合表達。結果顯示gE-6×His能夠在HEK293F細胞中表達，且有糖基化修飾。但其表達量很低，蛋白穩定性差，容易出現沉淀。利用Ni-NTA柱和陰離子交換柱進行純化后，純度仍很低，這可能是蛋白折疊過程中His被包裹在內，暴露太差的原因。而將標簽換成mFc后，蛋白表達量大大增加，蛋白穩定性也較好，利用Protein G柱一次純化后即獲得純度高達85%的蛋白。

同時本研究選用了mouse Fc和gE蛋白進行融合表達，在后期利用其免疫小鼠，可以產生更多gE抗體，而盡可能減少Fc抗體的產生。IgG-Fc融合蛋白是將生物活性蛋白與IgG的鉸鏈區和 Fc片段（CH2、CH3 功能區）進行基因重組而表達的融合蛋白，早已廣泛應用于人蛋白的表達［16］。加入的Fc片段能顯著提高融合蛋白的半衰期和穩定性［17］，并且能提高融合蛋白在哺乳動物細胞中的表達量，有利于融合蛋白的純化與檢測［18-19］。本研究將鼠IgG2-Fc片段與gE蛋白胞外區進行融合表達，產生的gE-mFc蛋白不僅穩定性好，且便于純化與檢測，能更好地應用于PRV診斷試劑的開發，同時也為今后制備更多的鼠單克隆抗體提供了好的思路。

無 論 是 gE-6×His還 是gE-mFc蛋 白， 在HEK293F懸浮細胞瞬時表達系統中表達后，獲得的蛋白均略大于理論值。通過生物信息學方法分析發現gE蛋白胞外區包含5個潛在的N-糖基化修飾位點和12個潛在的O-糖基化修飾位點。這也與之前的文獻報道一致。周金龍等［11］通過昆蟲細胞表達系統、敖敬群等［13］通過酵母表達系統表達的gE蛋白均出現蛋白大小大于理論值的情況。本研究中使用的HEK293F表達系統是哺乳動物表達系統，較昆蟲細胞表達系統和酵母表達系統有更復雜的翻譯后修飾加工體系，因此，兩次表達的gE-6×His蛋白和gE-mFc蛋白都得到比目的蛋白大的兩條帶，可能是HEK293F表達后對其進行翻譯后修飾加工如糖基化修飾所致。

近年來，已有很多關于PRV gE單克隆抗體的制備相關的文章［20-22］，市面上也有很多PRV gEELISA試劑盒，但其抗原大多是通過原核表達的gE蛋白，篩選出來的抗體與天然病毒結合能力不強。本研究通過哺乳細胞表達的gE-mFc蛋白具有穩定性好、半衰期長、便于純化和鑒定及蛋白活性更接近天然蛋白等優點。且其mouse Fc標簽是鼠的抗體Fc段，不會在小鼠免疫時產生免疫原性。但為了快速獲得gE單克隆抗體，本研究選擇在蛋白表達初期利用PRV滅活全病毒免疫小鼠，用哺乳細胞表達的gE-mFc蛋白進行ELISA篩選，獲得的抗體也能更好地與天然病毒結合，通過IFA進一步鑒定其特異性，獲得了9株單克隆抗體都能特異性與gE蛋白結合，為今后建立特異性強、穩定性好和結合能力高的PRV診斷試劑提供了條件。

4 結論

本研究成功構建了真核表達載體pcDNA3.4-gE-6×His和 pcDNA3.4-gE-mFc， 并 在 HEK293F細 胞中表達得到gE-6×His和gE-mFc可溶性蛋白。利用gE-mFc蛋白成功篩選到9株能特異性與gE蛋白結合的單克隆抗體，為今后PRV診斷試劑的開發奠定了良好的理論基礎。